體外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒,選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù),可獲得含重組的陽(yáng)性克隆.

實(shí)驗(yàn)原理：
    體外通過(guò)基因工程手段所構(gòu)建的含目的基因的重組質(zhì)粒,選用轉(zhuǎn)化和篩選技術(shù),可獲得含重組的陽(yáng)性克隆.在此陽(yáng)性克隆中, DNA 可在生物體系中大量擴(kuò)增,繁殖,保存以及表達(dá)目的基因的產(chǎn)物,這是PCR體外擴(kuò)增DNA所不能替代的.配合DNA重組技術(shù),所獲得的,不同目的需要的陽(yáng)性菌株已廣泛應(yīng)用于科研,醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域.
    質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化不同 細(xì)菌 有不同的轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān), 通常轉(zhuǎn)化效率可達(dá)105－107轉(zhuǎn)化子/μg DNA.獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)體菌的制備.感受態(tài)就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài),只有發(fā)展為感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定攝取外來(lái)的DNA分子. pUC18的LacZ基因區(qū)域當(dāng)有DNA片段插入時(shí),LacZ基因失活,轉(zhuǎn)化進(jìn)入 大腸桿菌 并在含有IPTG和X-gal培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí),會(huì)產(chǎn)生白色的克隆,不含插入片段的pUC18質(zhì)粒進(jìn)入宿主細(xì)胞生成藍(lán)色菌落.
DNA分子轉(zhuǎn)化分以下幾步：
1、 吸附-- 雙鏈DNA 分子吸附于受體菌表面；
2、 轉(zhuǎn)入--雙鏈DNA分子解鏈.一條鏈進(jìn)入受體菌,另一條降解；
3、 自穩(wěn)--外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；
4、 表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制,分裂, 轉(zhuǎn)錄翻譯.

實(shí)驗(yàn)試劑：
LB培養(yǎng)基
      質(zhì)粒DNA（含Amp抗生基因）,受體菌
      CaCl2 0.1M
      Amp

實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
1、 感受態(tài)細(xì)胞 制備及CaCl2處理：
1) 將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線,37℃培養(yǎng)16～20小時(shí).
2) 挑取單菌落轉(zhuǎn)入20mL LB培養(yǎng)基錐瓶中,37℃振蕩過(guò)夜.
3) 從中取2mL菌液轉(zhuǎn)入50mL LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)4－5小時(shí),測(cè)OD100達(dá)0.4～0.5.
4) 培養(yǎng)物于冰上10分鐘.
5) 轉(zhuǎn)入－50mL 離心管 ,于4000rpm下4℃離心10分鐘.
6) 棄上清,倒置離心管1分鐘,流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預(yù)冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分鐘.
7) 4,000rpm 4℃離心10分鐘,棄上清.
8) 加入2ml,0.1M CaCl2懸浮細(xì)胞,于4℃過(guò)夜.