質粒DNA粘附在細菌細胞表面,經(jīng)過熱擊處理,促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,再在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長.

一、原理
    質粒 DNA 粘附在 細菌 細胞表面,經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理,促進吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代,待質粒上所帶的抗菌素 基因表達 ,就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長.

二、器材
    旋渦混合器 ,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量 離心管 ,雙面微量離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯?制冰機, 恒溫搖床 ,培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp）,超凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫 培養(yǎng)箱 .

三、試劑
    培養(yǎng)基（不加抗菌素）,LB培養(yǎng)基（加抗菌素）,無菌ddH2O,IPTG,X-gal.

四、實驗準備
    無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）,20%IPTG（M/V）,2% X-gal（M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配）.

五、操作步驟
（1）事先將恒溫水浴的溫度調到42℃.
（2）從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100μl）感受態(tài)菌,立即用手指加溫融化后插入冰上,冰浴5~10min.
（3） 加入5μl連接好的質?；旌弦海―NA含量不超過100ng）,輕輕震蕩后放置冰上20min.
（4） 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置3~5min.
（5） 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻,然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.
（6） 在 超凈工作臺 中取上述轉化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻,待其冷卻后再涂）.
（7） 如果 載體 和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻.
（8） 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜.
（9） 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告.
（10）觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好.注意白色菌斑.

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