非洲豬瘟病毒核酸檢測試劑盒（恒溫熒光法）使用說明書
【產(chǎn)品說明】
本產(chǎn)品基于的恒溫熒光檢測技術(shù)，可針對抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟和骨髓等樣品中非洲豬瘟病毒的的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結(jié)果。
本產(chǎn)品用于非洲豬瘟病毒的檢測，檢出限為102 copies/μl。
【貨 號】 YRMBV7201-2
【包裝規(guī)格】 50T
【試劑盒組成】
| 試劑 | 規(guī)格及數(shù)量 | 存儲條件 |
| A-ASFV-I | 1100 μL/管 | -20°C |
| B-I | 50 μL/管 | -20°C |
| C-I | 1000 μL/管 | -20°C |
| PG-ASFV-I | 100 μL/管 | -20°C |
| NG | 100 μL/管 | -20°C |
【儲存條件及有效期】
-20℃保存，有效期為12個月（請在有效期內(nèi)使用）。
【適用儀器】
YR-820 恒溫擴增熒光檢測儀。
【樣品采集及存放】
待測樣品為 -20℃保存樣本或新鮮待檢樣本
【樣品處理】
可采集發(fā)病動物或同群動物的血清學樣品和病原學樣品，病原學樣品主要包括抗凝血、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟和骨髓等。如環(huán)境中存在鈍緣軟蜱，也應(yīng)一并采集。
樣品的包裝和運輸應(yīng)符合《高致病性動物病原微生物菌（毒）種或者樣本運輸包裝規(guī)范》規(guī)定。規(guī)范填寫采樣登記表，采集的樣品應(yīng)在冷藏和密封狀態(tài)下運輸?shù)较嚓P(guān)實驗室。
一、血清學樣品：無菌采集5ml血液樣品，室溫放置12～24h，收集血清，冷藏運輸。到達檢測實驗室后，冷凍保存。
二、病原學樣品
1．抗凝血樣品：無菌采集5ml抗凝血，冷藏運輸。到達檢測實驗室后，－70℃冷凍保存。
2．組織樣品
2.1 脾臟，其次為扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、骨髓等，冷藏運輸。
2.2 樣品到達檢測實驗室后，－70℃保存。
3．鈍緣軟蜱
3.1 將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶/管中，放入少量土壤，蓋內(nèi)襯以紗布，常溫保存運輸。
3.2 到達檢測實驗室后，－70℃冷凍保存或置于液氮中；如僅對樣品進行形態(tài)學觀察時，可以放入99%酒精中保存。
【檢測步驟】
自備材料和儀器：①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②滅菌0.2mL PCR管或八聯(lián)管；③冰盒；④移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；⑤離心機；⑥渦旋混勻器；⑦金屬浴
一、DNA提取（樣本制備區(qū)）
建議使用病毒基因組DNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見說明書。
二、試劑配制（試劑準備區(qū)，放置于冰盒中進行）
若有N個待檢樣品，則參照下表，按照N+2個數(shù)量計算各組分用量（N個待檢樣品+1個陰性對照NG+1個陽性對照PG），將反應(yīng)液置于0.6ml或者1.5ml離心管中，渦旋混勻，離心30秒，分裝于0.2ml PCR管中，并向每管加入1滴C-I（約20μl）。
| 試劑 | 使用量 |
| A-ASFV-I | 22×(N+2)μL |
| B-I | 1×(N+2)μL |
| 反應(yīng)液總體積 | 23×(N+2)μL |
三、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）
向PCR管中分別加入2μl模板，順序為陰性對照（陰性對照管可不加入模板）、待測樣品模板、PG-ASFV-I，離心30秒，立即進行擴增反應(yīng)。
四、擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
(一)、恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)30 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設(shè)置實驗名稱及反應(yīng)時間，將步驟三中離心后的PCR反應(yīng)管放入恒溫擴增熒光檢測儀，點擊開始檢測。
(二)、若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環(huán)，于63℃ 45 s處收集熒光信號，30個循環(huán)。
其他儀器請參照儀器說明書進行設(shè)置。
【結(jié)果判定】
1、 儀器自動判定結(jié)果，若顯示“陽性”，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；
若顯示“陰性”，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測限。
2、 在檢測儀上，根據(jù)有無“S”型擴增曲線判定結(jié)果。
若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有非洲豬瘟病毒；
若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有非洲豬瘟病毒或含量低于檢測限。
« 陰性對照反應(yīng)管結(jié)果顯示“陰性”，陽性對照反應(yīng)管結(jié)果顯示“陽性”，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
【注意事項】
1、本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。
1）一區(qū)：試劑準備區(qū)；2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)；第三區(qū)：模板添加區(qū)；第四區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。
★ 分區(qū)之間*進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2、實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3、嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4、反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當體積分管保存。
5、反應(yīng)結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6、不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。
原創(chuàng)作者：廈門科朋儀器有限公司
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