REAGEN 卡那霉素試劑盒
1．概述
REAGEN™ 卡那霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒是用于細胞裂解液、培養(yǎng)液、質(zhì)粒等樣本中卡那霉素殘留的定量檢測。該試劑盒有以下特點：
Ø 快速(10-40分鐘)，多種樣品的非有機溶劑的提取方法，高回收率(>80%)。
Ø 高靈敏度（0.2ppb）。
Ø 高重復(fù)性。
Ø 快速的ELISA檢測方法（不考慮樣本量的前提下只需不到1小時）。
2.試劑盒原理
REAGEN™ 卡那霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒基于競爭性酶聯(lián)反應(yīng)原理，抗原已經(jīng)包被于微孔板上。分析時，樣品、酶標物以及抗體加入孔中，如果樣品中含有藥物，會與微孔板上的抗原競爭抗體，同時酶標物與抗體結(jié)合。加入TMB底物，底物的顏色顯色強度與樣品中卡那霉素的含量成反比。
3.試劑盒組成
已包被抗原的酶標板(Kanamycin-coated Plate)（可拆式） 1×96孔
標準液(Standards)（0，0.2，0.6，1.8，5.4，16.2ppb） 6×1.0mL
高標液1000ppb（Spiking） 1×1.0mL
一抗(Antibody #1) 1×6.0mL
HRP酶標二抗(HRP-Conjugated Ab#2) 1×6.0mL
10×樣品稀釋液（10×Sample diluent） 1×15mL
20×濃縮洗液(Wash Solution) 1×28mL
TMB底物(TMB Substrate) 1×12mL
終止液(Stop Buffer) 1×12mL
本試劑盒應(yīng)當(dāng)在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果超過1個月不使用試劑盒，請將標品、一抗和二抗放置-20℃或者冰凍保存。
4.檢測限
| 檢測物質(zhì) | 檢測下限（ng/g） |
| 細胞裂解液/培養(yǎng)液/質(zhì)粒 | 0.2 |
5.交叉反應(yīng)
| 交叉反應(yīng)物質(zhì) | 交叉反應(yīng)率（％） |
| 卡那霉素(Kanamycin ) | 100 |
| 鏈霉素（Streptomycin） | < 0.1 |
| 雙氫鏈霉素（Dihydrostreptomycin） | < 0.1 |
| 新霉素(Neomycin) | < 0.1 |
6.未提供的設(shè)備或材料
1) 酶標儀
2) 離心機
3) 漩渦振蕩器
4) 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)
5) 多道移液器（50-300mL）
7.注意事項
實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得最佳實驗效果。
1) 標準品中含有卡那霉素，請小心使用。
2) 不要使用過期的試劑盒。
3) 不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。
4) 盡量保持室溫20-25℃，避免在通風(fēng)口操作防止溫度過低，過熱或者蒸發(fā)。同樣的，不
要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發(fā)。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應(yīng)該鋪墊若干紙巾或者其他物料。
5) 水質(zhì)量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。
6) 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。
7) 孵育時間的計算越規(guī)范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。
8) 從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質(zhì)量的風(fēng)險。
9) 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。
8.樣品的準備
確保樣品的正確保存，一般來說，樣品在2-4只能保存1-2天，如果要保存更長時間，就要保存在-20冷凍保存，在用之前需要將冷凍的樣品在室溫下或冰箱內(nèi)解凍。
準備1×樣品稀釋液:
1體積 10×樣品稀釋液加9體積蒸餾水稀釋。
細胞裂解液/培養(yǎng)液/質(zhì)粒
（1） 取200mL細胞裂解液等樣本，渦流震蕩混勻30秒；
（2） 4000×g離心5分鐘；
（3） 每孔取50mL上清液來檢測。
稀釋倍數(shù):1
9.檢測步驟
注意：試劑在使用之前要在室溫下解凍1-2小時，確定在使用前閱讀過注意事項。準備適量的檢測用試劑，所有的試劑搖勻后使用。準備足夠所有小管所需的用量，不能將試劑倒回原來的瓶子中，處理試劑時建議用廢棄的瓶子以降低污染的風(fēng)險。
1) 1x洗液的制備
1體積的20x洗液同19體積的蒸餾水混合。
檢測
以下為計算份量的表格，用戶可根據(jù)自己的需要來確定需要配置多少試劑。
| 試劑 | 每個反應(yīng)需要的體積 | 24次反應(yīng)的體積 |
| 一抗 | 50 mL | 1.2mL |
| 酶標二抗 | 50 mL | 1.2mL |
| 工作洗液 | 1 mL | 24 mL |
| 終止液 | 100 mL | 2.4mL |
| 底物 | 100 mL | 2.4mL |
（（1）加入50mL的標準品于所設(shè)定的孔中；
（2） 加入50mL的樣品于所設(shè)定的孔中；
（3） 按順序在每孔中加入50mL HRP酶標二抗和50mL一抗，輕敲微孔板邊緣混勻30秒；
（4） 室溫（22.5±2.5）°C避光孵育30分鐘；
（5） 洗板4次，每次應(yīng)該加入250mL 1×洗液，最后一次使板盡量甩干并在吸水紙上拍干；
（6） 加入100mL的TMB底物；計時，輕敲微孔板邊緣混勻30秒；
（7） 在室溫（22.5±2.5）°C避光孵育15分鐘，加入100mL的終止液終止反應(yīng)；
（8） 在450nm下讀OD值 (讀數(shù)前，最好用無絨布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。
10.結(jié)果計算
（1） 分別計算標準、質(zhì)控和樣品的平均吸光度值和相對吸光度值。
相對吸光度值 (%) = (標準或樣品吸光度值/零標準吸光度值) ´ 100
（2） 以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度為橫坐標建立標準曲線。
（3） 從標準曲線上讀取樣品的濃度值（通用計算軟件根據(jù)Log/Log標曲看線性和結(jié)果）。
以下曲線圖是卡那霉素酶聯(lián)免疫反應(yīng)測試盒典型標準曲線
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