1、緩沖液的準(zhǔn)備
目標(biāo)蛋白與組氨酸標(biāo)簽蛋白純化磁珠的結(jié)合性能將直接影響目標(biāo)蛋白的純化效率，而各種緩沖液配制也將在一
定程度上影響目標(biāo)蛋白的回收率和純度。因此，在較大規(guī)模蛋白純化之前，用戶應(yīng)該自行設(shè)計實驗，篩選出適合純
化目標(biāo)蛋白的緩沖液體系，主要包括 Binding Buffer、 WashingBuffer、 ElutionBuffer。
增加咪唑濃度進(jìn)行洗脫是組氨酸標(biāo)簽純化磁珠常用的洗脫方法，使用時，在不確定洗脫咪 唑濃
度情況下，推薦在緩沖液中分別加入 10 mM、 20 mM、 50 mM、 100 mM、 200mM、 300mM、 400 mM、 500 mM
咪唑，濃度從低到高分別洗脫，磁吸后收集蛋白上清液，之后通過 SDS-PAGE 電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。
以下提供的緩沖液體系適用于多數(shù)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化，供用戶參考。 Binding Buffer： 20 mM 磷酸緩沖液，
0~50 mM 咪唑， pH7.4 ； WashingBuffer： 20 mM 磷酸緩沖液， 50~100 mM 咪唑， pH7.4； Elution Buffer： 20mM
磷酸緩沖液， 100-500 mM 咪唑， pH7.4；
2、 磁珠預(yù)處理
預(yù)估蛋白表達(dá)量， 根據(jù) 30-40μg/mg 蛋白的結(jié)合量投入合適量的磁珠， 假如預(yù)估表達(dá)量為 10-20mg， 那么需要投入
500mg 的磁珠；
利用磁鐵或者磁力架去除磁珠保存液， 加入保存液相同體積的 Bingding Buffer 清洗 3 次， 每次上下翻轉(zhuǎn) 10-20 次，
去除上清液； 建議磁性分離時間為 30-60s。
3、 目標(biāo)蛋白與磁珠的結(jié)合
加入目標(biāo)蛋白樣品（建議目標(biāo)粗蛋白溶液與 Binding Buffer 相同， 如過不同， 建議使用超濾或者透析的方式進(jìn)行 Buffer
替換）， 震蕩混勻 30s， 室溫或者冷藏旋轉(zhuǎn)混勻 10-30 分鐘（如果目標(biāo)蛋白溫度穩(wěn)定性差， 可在冷藏條件下進(jìn)行， 適
當(dāng)增加結(jié)合時間至 1-2 個小時）。
4、 磁珠洗滌
加入合適體積的 Washing Buffer（建議體積為 1-2mL/100mg） ， 顛倒混勻數(shù)次， 磁性分離， 去除上清， 重復(fù)操作 3-
5 次直至沒有雜蛋白出現(xiàn)（建議使用分光光度計 OD280 進(jìn)行質(zhì)量控制）；
5、 目標(biāo)蛋白洗脫
用戶可根據(jù)需要改變洗脫體積調(diào)整目標(biāo)蛋白濃度，加入合適體積的 Elution Buffer，輕輕翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸
浮，磁性分離，收集洗脫液到新的離心管中，即為純化的目標(biāo)蛋白樣品； 如果需要，可以重復(fù)上述步驟 1 次，收集
樣品到新的離心管中，以檢測目標(biāo)蛋白是否洗脫*。
6、 磁珠后處理
（1）在裝有磁珠的離心管中加入 2mL/100mg 的 500mM 咪唑，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去
除上清液。
（2）重復(fù)上述步驟 2 次。
（3）在離心管中加入 2mL/100mg 的 ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠懸浮，磁性分離，去除上清液。
（4）重復(fù)上述步驟 2 次。
（5）加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 1 mL/100mg，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃），可用于
下一次同種蛋白的純化。
7、 磁珠再生
磁珠連續(xù)使用三次以上，其結(jié)合目標(biāo)蛋白的能力可能會明顯降低，建議進(jìn)行磁珠再生處理。
Stripping Buffer： 20 mM 磷酸緩沖液， 500 mM NaCl， 100 mM EDTA， pH7.4
Beads Washing Buffer（可選）： 0.5 M NaOH， 2 M NaCl
Recharge Buffer： 100 mM NiSO4（該化學(xué)試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應(yīng)，使用時務(wù)必注意）
Storage Buffer： 20%（v/v）乙醇
以 5 mL （500mg） 磁珠懸液為例，詳細(xì)說明磁珠再生操作：
（1）將磁珠懸液進(jìn)行磁性分離，去除上清液，從磁性分離器上取下離心管，在離心管中加入 5mLddH2O， 上下翻
轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。（2）加入 5 mL Stripping Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，
使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5min，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 1 次。
（3）加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液，重復(fù)此步驟 2 次。
（4）堿處理： 加入 5 mL Beads Washing Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 5 min，
磁性分離，去除上清液。加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重
復(fù) ddH2O 洗滌步驟 3~5 次，至洗滌液呈中性為止。（5）加入 5 mL Recharge Buffer，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使
磁珠重新懸浮，室溫旋轉(zhuǎn)混合 20min，磁性分離，去除上清液。
（6）加入 5 mL ddH2O，上下翻轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，使磁珠重新懸浮，磁性分離，去除上清液。重復(fù)此步驟 6 次以上，
保證鎳離子去除*。
（7）加入 Storage Buffer 到磁珠中使總體積為 5 mL，保存于 2~30℃（長期保存，置于 2~8℃）。
武漢邁思生物科技有限公司立足于解決行業(yè)內(nèi)功能活性蛋白及高質(zhì)量、高通量抗體開發(fā)難的痛點，依托自建的兩大核心平臺：哺乳細(xì)胞蛋白表達(dá)平臺和B細(xì)胞抗體開發(fā)平臺，竭誠為廣大科研機構(gòu)、高等院校、IVD企業(yè)、醫(yī)藥企業(yè)等提供一站式蛋白表達(dá)及抗體開發(fā)相關(guān)技術(shù)服務(wù)。
公司研發(fā)人員擁有數(shù)十年蛋白表達(dá)和抗體開發(fā)經(jīng)驗，行業(yè)*的技術(shù)儲備，平臺設(shè)備完善，尤其在功能活性蛋白表達(dá)、重組兔單克隆抗體開發(fā)、重組抗體表達(dá)，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建等方面擁有*技術(shù)水平。致力于為廣大科研和企業(yè)用戶提供包括原核表達(dá)、真核表達(dá)、多抗制備、單抗制備、中和抗體制備、抗體藥生產(chǎn)、重組抗體生產(chǎn)、雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)、抗體標(biāo)記、Elisa試劑盒開發(fā)等相關(guān)技術(shù)服務(wù)。用專業(yè)的技術(shù)水平，積極的響應(yīng)態(tài)度對待每一位行業(yè)用戶。
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| 產(chǎn)地 | 國產(chǎn) | 級別 | 其他 |
|---|
的層析設(shè)備。樣品與磁珠的特異性結(jié)合、洗滌以及目標(biāo)蛋白的洗脫變得簡單、快速、易操作。對于熟練的操作者而
言，在 1h 內(nèi)就能獲得高純度的目標(biāo)蛋白，且能輕松實現(xiàn)高通量和大規(guī)模樣品的平行處理，為研究者節(jié)省了時間和
成本。
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