美國    干細胞胎牛血清

一、 牛血清在細胞培養(yǎng)基中的主要功能
牛血清是細胞培養(yǎng)中用量zui大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。

1.提供對維持細胞指數(shù)生長的激素，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

2. 提供結(jié)合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。

3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合，起到解毒作用。

4.是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來源。

5.起酸堿度緩沖液作用。

6.提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

二、 牛血清的主要成份
血清是一種很復雜的混合物，其組成成份雖大部分已為人所知，但還有一部分尚不清楚，而且血清組成及含量常
隨供血動物的性別、年齡、生li條件和營養(yǎng)條件不同而異。

1.蛋白質(zhì)是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類蛋白外主要還有白蛋白，球蛋白。
纖維粘連素 細胞促進細胞附著；
α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白 促細胞附著；轉(zhuǎn)鐵蛋白 能結(jié)合鐵離子，減少其毒性
和被細胞利用。

2.多肽：血小板促生長因子能促細胞分lie，是多肽家庭的主要成員之一，是主要的促細胞增殖因子；成纖維細胞
生長因子、表皮細胞生長因子、神經(jīng)細胞生長因子等，血清中含量雖很少，但對細胞生長也有一定作用。

3.激素：激素對細胞的作用是多方面的。
胰島素：促進細胞攝取葡萄糖和氨基酸，與促細胞分lie有關。
類胰島素生長因子：能與細胞表達的胰島素受體結(jié)合，從而有胰島素同樣的作用。
促生長激素：促細胞增殖效應。
qing化ke的song：血清中含有定量的該成分，它可能兼有促細胞貼附和增殖作用，但有人證明，血清中的qing化ke的song
，如細胞密度高時可能有抑制細胞的作用和誘導其發(fā)生分化。

4其他成份
氨基酸、葡萄糖、酮酸等對多種營養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大。與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素對細胞培養(yǎng)有意
義。

三、 牛血清的質(zhì)量要求
隨著科學技術的發(fā)展和生活水平的不斷提高對生物醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來越高，所以對制備工藝中所涉及到
的各種原材料的質(zhì)量標準要求也越來越高，特別是對用于細胞培養(yǎng)基中的主要天然成份――牛血清的質(zhì)量要求也
不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。

（一）、WHO公布的《用動物細胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求：

1. 牛血清必須來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當?shù)谋O(jiān)測系統(tǒng)。

2.有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。

3.證明所用牛血清中不含對所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。

4.血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。

5.無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。

6.對細胞有良好的支持繁殖作用。

（二）、我國在對牛血清的質(zhì)量2000年版《中國生物制品主要原輔料質(zhì)kong標準》中提出比較嚴格的標準要求。包
括蛋白質(zhì)含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內(nèi)毒素，支持細胞增殖檢查。

（三）、美國對牛血清的質(zhì)量要求：Gibco 和Sigma二家主要的美國牛血清供應商的牛血清都已進入到我國市場，
他們對其質(zhì)量標準要求都極為嚴格，從血清來源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。

1） 血清來源：可從世界各國收集胎牛血清，但是必須符合他的質(zhì)量標準和美國*進口要求。地方當局還不
清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集，有說明血清質(zhì)量的證明資料：包括收集過程的全部資料、檢驗
結(jié)果和交付情況。

2）血清的收集：胎牛血清是心臟穿刺取血，新生牛（10～14天）和小牛（10個月內(nèi)）血清靜脈取血。血清采集條
件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標準：低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅
活。

3）血清的制備：
a. 超低IgG胎牛血清：通過親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白，使FBS γ球蛋白含量減到zui低，一般IgG≤5ug/ml，生物學活性不變。

b. 血清透析：用12000～14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量＜0.5mg/ml（用葡萄糖氧
化酶／過氧化酶方法測定）。

c. γ－射線照射：已經(jīng)證明γ－射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30～45KG。
而且這個劑量的γ－射線照射不會改變血清的理化性質(zhì)和對細胞培養(yǎng)的影響。

4）除菌過濾:經(jīng)過上述處理的粗制血清再經(jīng)過一系列除菌濾膜過濾包括0.2微米（micron）和0.1微米濾膜。FBS要
通過三層0.1微米濾膜，其他血清可通過0.2微米濾膜。

4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量

1）化學檢定：滲透壓
pH
蛋白含量――電泳法
白蛋白 球蛋白 血紅蛋白
隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應增加，總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。
2） 微生物學檢查：細菌、真菌符合USP標準。
支原體：在支原體專業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4周，培養(yǎng)溫度36℃±2℃
分別在需氧和厭氧條件下進行，有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次，Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法
無法檢出的支原體如豬鼻支原體等。

病毒檢查：
牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue
牛腺病毒 Bovine Adenovirus
牛細小病毒 Bovine Parvovirus
牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus
狂犬病病毒 Rabies
呼腸弧病毒 Reovirus
牛呼吸道合胞病毒 BRSV
副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza

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檢查方法：
已證明無外源因子污染的牛細胞培養(yǎng)物，在細胞生長液中加15％待測血清，連傳3代共21天。陰性對照細胞培養(yǎng)液
中加15％已知無病毒污染的牛血清，與試驗組同條件下進行。在觀察期內(nèi)注意細胞形態(tài)變化或細胞病變。在觀察
期內(nèi)第14天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。

如待檢細胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細
小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽性對照，再培養(yǎng)7天，用熒光
抗體技術進行檢查。

細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細胞、
豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在2～8℃和20～24℃進行。陰性對照細胞預先感染副流感
Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。

3）內(nèi)毒素檢測
用鱟試劑檢查。

4）細菌噬菌體檢查
主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。

5）激素含量測定
每批FBS對某些激素含量都要進行測定，包括：雌二醇、胰島素、孕硐、睪wan素、甲狀腺素等。

6）血紅蛋白檢測
血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70％，血紅蛋白含量≤mg15/dl。

7）細胞生長效果測定
a.細胞克隆效果測定
細胞選擇：Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653
血清濃度與細胞數(shù):
10％血清／1個細胞／孔
4％血清／5個細胞／孔
細胞培養(yǎng)基RPMI－1640， 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃，5％二氧化碳培養(yǎng)10～
15天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。
克隆效率計算：
克隆效率＝(陽性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100％ 

相對克隆效率＝待測血清克隆效率/參考血清克隆效率

b.貼壁效率試驗：
用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗，A549（人肺癌細胞）該細胞可以反應出低濃度血清的貼壁變化。采
用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數(shù)即10％血清――100細胞／孔，4％血清200介細胞／孔
。放36℃±2℃，濕潤5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14天，計算著色細胞克隆，確定貼壁效率。從這兩種不同血清
濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平，分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。

貼壁效率（％）＝(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細胞平均數(shù)) X100％

相對貼壁效率＝被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率
c. 二倍體纖維細胞促生長試驗
人二倍體細胞株 WI28 MRc5

25cm2細胞培養(yǎng)瓶，5％血清，每瓶接種1.5X105細胞連傳3代，每代血清濃度和接種細胞數(shù)相同，每代培養(yǎng)7天，每
代接種二個細胞瓶，36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養(yǎng)。每代收獲細胞計數(shù)，計算每批待
檢血清與參考血清的相對生長率（RGR）。

RGR＝(試驗血清每瓶細胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細胞平均數(shù)) X100％

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ELISA試驗中，各種檢驗項目的誤差允許范圍均有待在實踐中得出結(jié)論，以上只是舉例說明質(zhì)控方法，不是定論。2SD是一般*的允許誤差限度。每批測定放一份質(zhì)控血清時，一次超過2SD應作為"告警"，二次超出2SD為"失控"。當質(zhì)控過程中，出現(xiàn)失控時，出現(xiàn)失控時，應查找原因，通常是試劑盒或質(zhì)控血清失效造成。更換試劑盒或更換質(zhì)控血清，找出原因糾正后重新檢驗。如果檢驗結(jié)果仍達不到要求或找不到原 因時，應重復進行OCV的檢驗。如果OCV檢驗的結(jié)果仍是好的，說明常規(guī)操作出現(xiàn)問題。一般認為：①一次超出3SD。②連續(xù)二次超出2SD。③3-5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)。 ④5～7次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。5.2.1 質(zhì)控血清的使用 衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質(zhì)控血清，可以在-20℃保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應先混勻，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按3-6個月用量準備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內(nèi)效價不變，其理化性質(zhì)應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。

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*類，zuiGAO級別，是專門用于干細胞 的特級胎牛血清
1、Hyclone的特級胎牛血清
目前，性能的血清，還是要說說Hyclone的特級胎牛血清，貨號是SH30070.03，它是Hyclone的“招牌菜”。
Hyclone特級胎牛血清(Defined FBS)，貨號SH30070，是世界上唯yi經(jīng)過40納米過濾的頂ji胎牛血清，的促細胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性。內(nèi)毒素含量≤10EU/ml，血紅蛋白含量≤10mg/dl。
此血清可以廣泛用于各種細胞培養(yǎng) ，包含任何干細胞系的培養(yǎng)。
因為美國那邊有瘋牛病，無法進口。實際上，40nm的過濾，已經(jīng)將全部的病毒、支原體處理掉，同時，是用于科研級別的，潔凈程度非常高。不讓進口，只是我們國家為了保護本國畜牧業(yè)的一個手段，針對牛肉方面，而胎牛血清是受到殃及而已。
2、Gibco的特級胎牛血清
稍次一點的是Gibco公司在美國原裝生產(chǎn)的特級胎牛血清，這款血清，貨號是16000-044，是100nm過濾3次，內(nèi)毒素和血紅蛋白含量都可以與Hyclone的SH30070.03相媲美。也可以用于培養(yǎng)大部分的干細胞 系。同樣是美國來源，所以渠道特殊。
3.TCB的特級胎牛血清
TCB(Tissue Culture Biologicals)公司作為一家生物行業(yè)類的供應商，成立于1978年，大部分血清的采集和加工都在加利福尼亞。每一批的原材料都經(jīng)過嚴格篩選，所有的產(chǎn)品都在FDA認證的cGMP車間進行!
TCB 公司一貫重視產(chǎn)品質(zhì)量，為客戶提供zui的血清及相關產(chǎn)品，經(jīng)過多年的發(fā)展，公司產(chǎn)品種類豐富，各種品質(zhì)的血清和培養(yǎng)基能滿足所有實驗室的需求。
TCB 公司經(jīng)過美國食品*(FDA)和美國*(USDA)的*認證。與人相關的產(chǎn)品符合疾控中心(CDC)的相關法規(guī)。
TCB是美國*(USDA)動植物 *(APHIS)獸醫(yī)處(VS)下屬的國家動物進出口中心(NCIE)的檢疫認可單位，允許可控原材料、組織、細胞等的進出口貿(mào)易!
4. Bioind特優(yōu)級胎牛血清
血源來自北美和澳大利亞BioInd公司的生產(chǎn)*符合GMP的要求，并通過ISO9000:2001和ISO 13485:2003質(zhì)量認證。
以安全，穩(wěn)定，為原則的BioInd公司，所有的產(chǎn)品質(zhì)量均*符合標準。Biological Industries主營細胞培養(yǎng) 類產(chǎn)品，BioInd工廠加工的胎牛血清均符合USDA標準及歐洲標準血清。根據(jù)美國*標準，原始血清均采自未發(fā)生瘋牛病(BSE)和口蹄疫(FMD)疫情的國家。Biological Industries三步濾菌處理法，zui后的過濾步驟為連續(xù)通過三個100納米的濾膜。血清生產(chǎn)的潔凈級別為100級。所有分裝工作臺都通過微?？諝膺^濾器過濾，并保持正壓分裝環(huán)境要對總微粒、懸浮微粒數(shù)和壓力進行監(jiān)控。分裝之后，終產(chǎn)品迅速-20度凍存，并隔離，直到所有的質(zhì)量控制檢測完成.
第二類，優(yōu)等胎牛血清
給您推薦幾款，如下：
1、Hyclone的加拿大優(yōu)等胎牛血清
的是Hyclone加拿大優(yōu)等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396.03 血清采自加拿大，由hyclone公司總部的員工采集加工，采集方法，加工過程，檢定標準與美國原產(chǎn)優(yōu)等胎牛血清*一致，市場*美國原產(chǎn)的。經(jīng)過3次100nm過濾，內(nèi)毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/dl
2、Hyclone的南美優(yōu)級胎牛血清
大體與加拿大的優(yōu)等血清是一樣的，級別也非常相似，貨號是sv30087.02，該胎牛血清來源于南美洲，以封閉的心臟穿刺方式采集，產(chǎn)品經(jīng)3次100nm 過濾，經(jīng)嚴格檢測確保無支原體，細菌病毒檢測依據(jù)美國藥典(USP)和美國聯(lián)邦法規(guī)第九篇(9CFR)，內(nèi)毒素含量≤10 EU/ml，血紅蛋白含量≤20 mg/dl，*符合美國 HyClone? 優(yōu)等胎牛血清的檢測標準。
3、Gibco的澳大利亞胎牛血清
情況和Hyclone的澳大利亞胎牛血清差不多，市場價也是3200元/500ml左右。
這一級別的血清，也能用于干細胞培養(yǎng)，可是，不象特級胎牛血清那么。
因為，此胎牛血清屬于澳大利亞生產(chǎn)的，不在疫區(qū)，可以正常報關進口，目前沒有受到任何影響，所以，就目前而言，算是的胎牛血清了，有不少客戶都此血清來培養(yǎng)干細胞，效果還是比較不錯。
4、TCB的優(yōu)級胎牛血清
情況和Hyclone的澳大利亞胎牛血清差不多，市場價也是2300元/500ml左右。
這一級別的血清，也能用于干細胞培養(yǎng)，可是，不象特級胎牛血清那么。
第三類，一般級別的進口胎牛血清
1、Hyclone的南美胎牛血清
目前，市場上用的zui多的Hyclone血清是南美胎牛血清(FBS)SV30087 ，此血清采自南美，在國內(nèi)(蘭州)過濾并測試檢驗，經(jīng)三次100納米過濾，根據(jù)中國商標法的規(guī)定標貼中文標簽，內(nèi)毒素含量≤10EU/ml,血紅蛋白含量≤20mg/d。
此血清廣泛用于各種腫瘤細胞的培養(yǎng)，還沒有資料記載能夠用于干細胞，也聽說有少數(shù)人用于干細胞培養(yǎng)的，不過，因為本身血紅素比較高，所以，不要用于干細胞，
2、Gibco的南美胎牛血清
這款血清，是Gibco針對Hyclone南美胎牛血清做的，價格比較貴，好像是1780元/500m。
3、Gemini的胎牛血清
4、TCB的胎牛血清
5、PAA的胎牛血清
6、JRH澳洲胎牛血清
第四類，國產(chǎn)的各種系列胎牛血清
國產(chǎn)的胎牛血清，國內(nèi)沒有嚴格意義的胎牛血清，胎牛血清本身是需要穿刺取血的，而國內(nèi)都是剖腹產(chǎn)出胎牛，8小時左右取血，然后，進行過濾分裝。

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血清淀粉樣蛋白A(SAA)

大鼠鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運ATP酶β1肽(ATP1β1)檢測ELISA Kit

Immunoglobulin A (IgA)Bos taurus; 牛

大鼠激肽釋放酶5(KLK5)檢測ELISA Kit

人骨織素(OSTN)檢測ELISA Kit

人分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測ELISA Kit

人艾杜糖-2-硫酸酯酶(IDS)檢測ELISA Kit

人過氧化還原酶2(PRDX2)檢測ELISA Kit

小鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶2(AST2)檢測ELISA Kit