厭氧培養(yǎng)管具體操作流程

亨蓋特Hungate厭氧滾管培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養(yǎng)計數(shù)，還可以用于有害*菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭狀芽孢桿菌）的分離與鑒定。
亨蓋特Hungate厭氧滾管技術(shù)是美國微生物學(xué)家亨蓋特（Hungate）于1950 年提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)。以后這項技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趨完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。而且多年來的實踐已經(jīng)證明它是研究嚴格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。
1.銅柱系統(tǒng)除氧
銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故當這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃色變?yōu)楹谏?。當向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的氧就結(jié)合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的黃色。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除氧的目的。當然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。
5.2 預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備
制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時，先將配制好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊脂培養(yǎng)基裝4.5-5ml，稀釋液裝9ml，并插入通N2氣的長針頭以排除O2。此時可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—刃天青由藍到紅zui后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。
5.3 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備
在無菌條件下準確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品，而后加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震蕩器將其震蕩均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液至另一支裝有9ml生理鹽水的試管中，制成10-2稀釋液。按此操作方法依次進行10倍系列稀釋至10-7，制成不同濃度的樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個稀釋度進行滾管培養(yǎng)計數(shù)。
5.4厭氧滾管培養(yǎng)法
將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于50℃左右的恒溫水浴中，用1ml無菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個稀釋度的稀釋液各0.1ml于融化了的瓊脂培養(yǎng)基螺口厭氧試管中，而后將其平放于盛有冰塊的盤中或特制的滾管機上迅速滾動，這樣帶菌的融化培養(yǎng)基在螺口厭氧試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。每個稀釋度重復(fù)3次，而后置于37℃（酸奶樣品42℃）恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)24—48小時后，即可在螺口厭氧試管的瓊脂層內(nèi)或表面長出肉眼可見的菌落。