聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能強大的技術(shù)之一。實時熒光定量PCR 是在標(biāo)準(zhǔn) PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上演變而成,常用于定量樣本中的 DNA 或RNA。利用熒光探針或熒光 DNA 結(jié)合染料,采用實時熒光定量PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應(yīng)所需的熱循環(huán),實現(xiàn)擴增產(chǎn)物的定量。實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經(jīng)過優(yōu)化以確保所有反應(yīng)參數(shù)均設(shè)置精確,從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。
1、引物和探針的儲存
盡管引物和探針的儲存經(jīng)常被忽略,但其在保證實時熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩(wěn)定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間暴光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。圖3擴增曲線分別顯示了儲存不當(dāng)?shù)囊?(A) 與儲存適當(dāng)?shù)囊?(B) 產(chǎn)生的效果。
2、長期保持引物和探針的穩(wěn)定性保持引物和探針的穩(wěn)定性的關(guān)鍵有四點:
(1)低壓凍干的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解,即應(yīng)置于 -20°C 保存,且若保存時間超過一年則應(yīng)對其進行監(jiān)測,看它是否出現(xiàn)功能下降。
(2)對于標(biāo)記的引物和探針,則應(yīng)采取措施避免標(biāo)記物暴光 (例如使用不透明管及置于暗處保存),以延長它們的使用壽命。
(3)引物濃度也可影響其穩(wěn)定性。建議引物的儲存濃度不低于10 μM;實際上,在大多數(shù)情況下,100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應(yīng)分裝保存,以減少凍融次數(shù),特別是標(biāo)記的引物和探針。
(4)最后,TE 緩沖液可形成比水更為穩(wěn)定的環(huán)境。此外,含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩沖液 (標(biāo)準(zhǔn) TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液,這是由于一些 PCR 反應(yīng)對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。
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