在上市之前，生物制品的工藝開發(fā)可以分為三個(gè)階段，分別為臨床前階段、一二期臨床階段、三期臨床及商業(yè)化生產(chǎn)階段。通常三個(gè)階段的規(guī)模并不相同，因此在兩次工藝轉(zhuǎn)移時(shí)往往伴隨著工藝的放大。
圖1 生物制品工藝開發(fā)階段
作為下游純化的主要工藝，切向流過濾及層析已有成熟的放大策略，可以降低放大過程中工藝本身的風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，物料及設(shè)備同樣會(huì)對(duì)工藝放大過程產(chǎn)生影響，在引入時(shí)即要秉持以終為始的理念，面向生產(chǎn)需求進(jìn)行選擇。
物料的風(fēng)險(xiǎn)控制
???選擇生產(chǎn)級(jí)別的物料
• 物料的級(jí)別要符合生產(chǎn)的級(jí)別，人用藥物生產(chǎn)盡量選擇GMP級(jí)別物料
• 物料的供應(yīng)需要滿足生產(chǎn)的要求。供應(yīng)商應(yīng)有足夠產(chǎn)能，并可保證生產(chǎn)的持續(xù)性，滿足最終生產(chǎn)規(guī)模的需要。
• 物料的供應(yīng)鏈貨期可以滿足工藝開發(fā)的時(shí)間線，防止因物料延誤產(chǎn)品上市。
???避免物料的污染
• 盡量采用非動(dòng)物來源的物料，應(yīng)檢查產(chǎn)品的TSE和BSE證明。
• 相應(yīng)等級(jí)物料應(yīng)具備無菌、內(nèi)毒素限度、菌落限度證明。
???選擇與產(chǎn)品/中間品等相容的物料
• 需檢查與產(chǎn)品/中間品接觸物料的溶析出、化學(xué)耐受性以及無相關(guān)酶類證明。
???選擇可放大的物料
• 工藝開發(fā)中所選擇的濾器、膜包、中空纖維等耗材，應(yīng)有適合生產(chǎn)規(guī)模的型號(hào)。層析填料應(yīng)有足夠的機(jī)械性能，可以支持大規(guī)模裝柱。
工藝的風(fēng)險(xiǎn)控制
工藝選擇
在一些樣品珍貴的產(chǎn)品(如mRNA)工藝開發(fā)過程中，臨床前研究時(shí)為節(jié)省樣品，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模通常較小，工藝中會(huì)采用試劑盒等方式。因此在首次放大時(shí)，需要選擇適合的替代工藝，通常生產(chǎn)規(guī)模會(huì)有多種可選的技術(shù)，最佳工藝選擇一般由最終生產(chǎn)規(guī)模決定。
工藝放大策略
線性放大是目前純化工藝包括死端過濾、切向流過濾和層析放大采用最多的策略。
切向流線性放大中需要保持流路長(zhǎng)度和流路內(nèi)流體動(dòng)力學(xué)情況的一致。前者要求實(shí)驗(yàn)室規(guī)模工藝開發(fā)時(shí)，即選用流路長(zhǎng)度與放大規(guī)模使用的膜包或中空纖維型號(hào)一致的小型濾器。處理粘度較高的樣品時(shí)流體動(dòng)力學(xué)情況會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致放大后超濾行為的不可預(yù)測(cè)，因此工藝中采用的濃縮因子盡量避免超過50，滲濾體積盡量低于14倍。
層析線性放大時(shí)保持柱床高度不變，擴(kuò)展層析柱的直徑。當(dāng)柱直徑超過30cm后會(huì)導(dǎo)致柱壁對(duì)填料的支撐降低，高流速運(yùn)行下柱床更容易塌陷。除選用有放大案例的填料外，小試規(guī)模確定流速等工藝參數(shù)時(shí)，應(yīng)參考填料的壓力流速曲線性質(zhì)。
需要注意壓力流速曲線通常使用水或簡(jiǎn)單緩沖溶液測(cè)定，如果層析步驟的某階段液體粘度較大(如結(jié)合洗脫模式蛋白洗脫階段、CIP堿清洗階段、以及復(fù)雜樣品上樣階段等)，應(yīng)進(jìn)一步降速運(yùn)行。
圖2 百林科Chromstar® 6FF及
MaXtar® ARPA壓力流速曲線
線性放大的缺點(diǎn)之一，是層析柱的直徑并非連續(xù)，在某些案例中保持柱床高度會(huì)導(dǎo)致柱體積明顯超過實(shí)際需要的填料數(shù)量，從而造成浪費(fèi)。在親和、不依賴柱效的離子交換和疏水層析中，可以采用恒定保留時(shí)間的放大策略，該策略下柱床高度會(huì)發(fā)生變化，柱床高度高于小規(guī)模時(shí)尤其需要注意層析柱超壓和柱床塌陷的情況。
層析柱裝填
層析柱裝填方法應(yīng)當(dāng)穩(wěn)健可靠，確保柱效測(cè)定結(jié)果滿足工藝需求。通常用不對(duì)稱因子衡量填料壓縮是否合理，對(duì)稱因子可接受范圍應(yīng)在0.8~1.8內(nèi)，并滿足分離的要求。裝柱過緊可能會(huì)使柱床破裂，產(chǎn)生溝流并導(dǎo)致樣本過早流穿。過松的柱床可能在使用中被再次壓縮，產(chǎn)生液體間隔并在其中發(fā)生混合，降低分離效果。對(duì)依賴塔板數(shù)進(jìn)行分離的層析過程，如分子篩、切峰收集的離子交換等，理論塔板數(shù)也應(yīng)滿足工藝要求。
其他
需要確認(rèn)樣品在室溫的穩(wěn)定性；使用pH值不受溫度影響的緩沖液；確認(rèn)更大規(guī)模時(shí)層析填料保存方式等
設(shè) 備
工藝放大后所使用的設(shè)備與小規(guī)模使用的設(shè)備即使采用同一原理和設(shè)計(jì)，往往也存在一些差異。
供應(yīng)商應(yīng)保證設(shè)備滿足衛(wèi)生設(shè)計(jì)的要求，保證設(shè)備不銹鋼部件的拋光、焊接質(zhì)量、接觸物料部位的表面處理等，防止規(guī)模放大后可能的清潔死角和銹蝕污染。需要在放大后規(guī)模上檢查清潔方法的適用性。
圖3 百林科金屬加工工藝
在此基礎(chǔ)上，設(shè)備的一些細(xì)節(jié)也會(huì)對(duì)工藝產(chǎn)生的影響。比如：放大后層析系統(tǒng)紫外檢測(cè)流通池的光徑是否有變化；出口管路不同的長(zhǎng)度和直徑可能會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)中更顯著的稀釋和擴(kuò)散；系統(tǒng)控制閥門響應(yīng)速度導(dǎo)致的時(shí)間延遲，疊加更大的系統(tǒng)死體積可能導(dǎo)致峰收集起點(diǎn)和終點(diǎn)的錯(cuò)誤；層析柱分配器的液流分布可能影響分離效果等放大規(guī)模的層析系統(tǒng)選型，主要的考慮是滿足工藝步驟中的流速需求，一般來說工藝流速會(huì)在設(shè)備最大流速的中值附近。這與選擇實(shí)驗(yàn)室層析系統(tǒng)的考量不盡相同，實(shí)驗(yàn)室層析設(shè)備為覆蓋不同工藝情況，流速范圍往往較寬。
圖4 百林科實(shí)驗(yàn)室層析系統(tǒng)及層析空柱
實(shí)驗(yàn)室裝柱可以采用軸向壓縮法或高流速法，高流速法裝柱所需要的線流速，放大后往往超出工藝運(yùn)行最適配層析系統(tǒng)的上限。由于層析柱耐壓隨直徑降低，高流速恒壓法裝柱放大也存在硬件的限制。為裝柱選擇更大規(guī)模的層析系統(tǒng)或高壓層析柱并不經(jīng)濟(jì)，通常會(huì)采用軸向壓縮法裝柱。對(duì)于直徑小于300mm的層析柱，手動(dòng)柱即可滿足裝柱要求；而直徑450mm以上裝柱，則需要具備電動(dòng)軸向壓縮功能的層析柱。
圖5 百林科Chrom-LinX® 手動(dòng)壓縮層析柱和
Verdot Ips2 InPlace工業(yè)層析柱
硬件的影響往往不會(huì)立刻顯現(xiàn)，選擇可靠、響應(yīng)迅速的供應(yīng)商及時(shí)處理問題，可以降低生產(chǎn)可能面臨的風(fēng)險(xiǎn)。
純化工藝放大是一個(gè)綜合多因素的過程，盡管有著許多成功的案例，在面對(duì)一個(gè)新工藝的放大時(shí)仍然需要保持謹(jǐn)慎。尤其在實(shí)際的工藝中，由于資源和時(shí)間的限制，并不能以理想的方式完成工藝開發(fā)和放大的過程。以上列舉了一些純化工藝放大中常見的問題，推薦在執(zhí)行工藝放大時(shí)，使用差距分析(GAP analysis)和失效模式與效應(yīng)分析(Failure Modes and Effects Analysis，F(xiàn)MEA)等工具，針對(duì)具體的工藝情況分析規(guī)模間差距、評(píng)估過程風(fēng)險(xiǎn)并采取相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，提高工藝放大的成功率。
總 結(jié)
純化工藝放大是一個(gè)綜合多因素的過程，盡管有著許多成功的案例，在面對(duì)一個(gè)新工藝的放大時(shí)仍然需要保持謹(jǐn)慎。尤其在實(shí)際的工藝中，由于資源和時(shí)間的限制，并不能以理想的方式完成工藝開發(fā)和放大的過程。以上列舉了一些純化工藝放大中常見的問題，推薦在執(zhí)行工藝放大時(shí)，使用差距分析(GAP analysis)和失效模式與效應(yīng)分析(Failure Modes and Effects Analysis，F(xiàn)MEA)等工具，針對(duì)具體的工藝情況分析規(guī)模間差距、評(píng)估過程風(fēng)險(xiǎn)并采取相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，提高工藝放大的成功率。
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