羥基磷灰石是一種無(wú)機(jī)純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，其球體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑較為均勻。羥基磷灰石與生物分子之間具有多種模式的相互作用，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子交換和鈣金屬親和兩種分離機(jī)制。陽(yáng)離子交換主要依賴于羥基磷灰石上帶負(fù)電荷的磷酸基，同時(shí)，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通過(guò)金屬親和作用與羥基磷灰石上的鈣形成更強(qiáng)的結(jié)合。由于這些分離機(jī)制，使得羥基磷灰石成為當(dāng)今要求很高的下游工藝中重要的層析介質(zhì)，在抗體、疫苗(細(xì)菌多糖、肺炎多糖、病毒等)、核酸、酶和重組蛋白等生物制藥領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用?？梢杂糜谒拗鞯鞍?HCP)、脫落的ProteinA、抗體二聚體及聚合體、核酸及病毒的分離，經(jīng)常用于捕獲、粗純或精純各個(gè)純化階段。
百林科目前共有兩款羥基磷灰石層析介質(zhì)：BaronCHT type I和BaronCHT type II，兩種型號(hào)主要由不同燒灼溫度及時(shí)間生成，Ⅰ型為400℃、Ⅱ型為 700℃。目前上市的兩款CHT主要粒徑為40um。
圖1：百林科羥基磷灰石電鏡圖
CHT I型的蛋白載量比較高，適用于純化單、雙抗、重組蛋白等項(xiàng)目，且對(duì)酸性蛋白具有更高的載量。CHT II型載量較I型載量低，對(duì)核酸及某些蛋白具有更好的分辨率，適用于純化質(zhì)粒、mRNA等類型項(xiàng)目。CHT II型對(duì)白蛋白有低的親和力，更適合純化各類免疫球蛋白及其亞型。
羥基磷灰石因含有鈣和磷酸根存在，可穩(wěn)定的使用pH6.5-14溶液中,兼容以下試劑:
目前使用羥基磷灰石最主要的痛點(diǎn)有兩個(gè)：一是壽命，通常CHT壽命一般在40個(gè)Cycle左右，但是與具體的使用條件息息相關(guān)；二是該如何做工藝的優(yōu)化。
???影響CHT的壽命的常見(jiàn)因素
? 雜質(zhì)較多較粘稠的料液會(huì)嚴(yán)重影響填料壽命。
? 使用過(guò)程中PH環(huán)境長(zhǎng)期暴露在 pH 6.5及以下酸性條件下降會(huì)造成CHT 的損壞導(dǎo)致減少 CHT 的使用次數(shù)。
? 羥基磷灰石使用時(shí)的所有緩沖液中均不能含檸檬酸或EDTA，這些整合劑會(huì)降解羥基磷灰石降低其使用壽命。
???提升CHT壽命的技巧
? 溶液中添加磷酸根或是鈣離子也可提升羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定維持其使用壽命及性能(鈣離子Ca2+會(huì)與磷酸根產(chǎn)生沉淀反應(yīng)，添加量不宜超過(guò)2mM)。
? 在實(shí)驗(yàn)時(shí)，洗脫前增加一個(gè)弱堿洗脫步驟能夠大幅提高柱子壽命，比如使用表面中和體系溶液(surface neutralization system，SNS)25mM Tris-HCl，25mM NaCl，5mM phosphate pH7.75運(yùn)行 6-8CV。這種SNS溶液可以有效減少洗脫過(guò)程中的PH漂移程度和使用過(guò)程中層析柱反壓的升高，能有效地減少羥基磷灰石鈣離子的流失，以助于提升填料的壽命。
? 同時(shí)加入Arginie，lysine，histidine，PIPES，HEPES，MES，MOPS，的添加也能大幅度減低 CHT 中質(zhì)子釋放，使PH下降的幅度大大減少，減少了 CHT暴漏在低pH環(huán)境的時(shí)間而提高CHT 的使用次數(shù)。
圖2：在溶液中添加MES對(duì)于pH 漂移的影響
羥基磷灰石 使用原理及優(yōu)化策略
羥基磷灰石包括兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：Ca和 PO4，這些結(jié)合位點(diǎn)按照其自有的晶體結(jié)構(gòu)分布。 PO4離子與帶正電的蛋白質(zhì)以離子鍵結(jié)合，具有陽(yáng)離子交換特性；其中的Ca離子與帶負(fù)電蛋白質(zhì)的自由羧基簇以金屬鰲合方式結(jié)合。
不同的結(jié)合模式下的使用策略：
? 陽(yáng)離子交換作用：當(dāng)?shù)鞍讕д姾蓵r(shí)候，可以與 PO4結(jié)合，而與Ca是相互排斥，這種作用主要是陽(yáng)離子交換作用。這種陽(yáng)離子交換作用會(huì)受到洗脫緩沖液中的中性鹽濃度 (如NaCl) 或者平衡液中磷酸鹽濃度的影響。這種作用隨著 pH 的增高也會(huì)相應(yīng)減弱。因此，增加鹽、磷酸鹽的濃度或增高 pH，都會(huì)減弱目的蛋白與PO4之間的相互作用。
? 鈣金屬鰲合作用：Ca可以與蛋白或其他分子(如核酸)表面的羧基簇或磷酸基團(tuán)發(fā)生金屬整合作用，而同時(shí)與 PO4相排斥。這種結(jié)合方式作用力是一般離子交換的 15-60 倍。所以這種結(jié)合方式受離子的影響比較小，對(duì) NaCl不敏感。而且這種作用力隨著離子強(qiáng)度會(huì)增加鈣金屬整合力，原因是由于離子強(qiáng)度的增加屏蔽了分子表面功能基團(tuán)與 PO4之間的相互排斥作用。這種結(jié)合方式可以通過(guò)磷酸鈉進(jìn)行洗脫。
圖3：羥基磷灰石作用原理圖
因此，基于上述兩種作用機(jī)理，羥基磷灰石使用的常規(guī)緩沖溶液選擇一般為第一種：平衡液10mM PB PH6.8、洗脫液400mM PB PH6.8；第二種：平衡液10mM PB PH6.8、洗脫液10mM PB+1M NaCl PH6.8。
如果遇到結(jié)合弱，容易流穿，以及洗脫難度大，可以采用以下辦法：
1. 對(duì)于結(jié)合力較弱的樣品可以降低平衡液中磷酸鹽濃度提高結(jié)合能力。
2. 對(duì)于洗脫難度較大的樣品可以使用高濃度的磷酸鉀溶液進(jìn)行洗脫。
羥基磷灰石的常見(jiàn)再生方法：
a. 對(duì)于羥基磷灰石的再生一般使用500mM 中性磷酸鹽或磷酸鉀溶液或400mM 磷酸鈉清洗 3-5CV完成再生。
b. 也可以用包含 5mM 磷酸根的中性KCl，NaCl，6M 尿素或 8M 鹽酸胍清洗柱子。
c. 由于羥基磷灰石自身性質(zhì)具備很高的耐堿性，因此對(duì)其清潔消毒最高可以使用到2M NaOH(常規(guī)0.5M即可)，其保存溶液也可以直接選擇0.1~1M NaOH。如果要使用低于0.1M NaOH進(jìn)行保存，則需向保存液中添加10mM濃度的磷酸鹽。
羥基磷灰石的裝柱技巧：
1) 裝柱時(shí)，由于羥基磷灰石自身材質(zhì)的問(wèn)題，不具有壓縮性。
2) 要使用流速裝柱而不要使用重力沉降裝柱。
3) 在裝柱過(guò)程中，剪切力很容易破壞顆粒，為了避免破壞，裝柱時(shí)候要選擇30%~50%的勻漿比，使用最小的力量輕輕的混合。
4) 對(duì)于40um CHT，一般使用10um 的篩板
5) 最終下沉柱頭時(shí)不要接觸到填料，當(dāng)柱子裝好后，要保持柱床穩(wěn)定?？蓞⒖及倭挚艬aron CHT填料說(shuō)明書(shū)中的裝柱步驟方法可獲得更好的裝柱幫助。
基于CHT的特殊的作用原理，通常它會(huì)帶來(lái)常規(guī)介質(zhì)不能達(dá)到的效果，也經(jīng)常被用于雙抗的純化，重組蛋白的純化以及一些多糖疫苗和重組因子類等產(chǎn)品的純化。
CASE 1 CHT 用于雙抗中進(jìn)一步提升純度
雙抗項(xiàng)目，用于去除聚集體實(shí)現(xiàn)更高的純度，SEC純度由95%提升至99%，回收率86%。
● 層析柱：4.7mL Baron CHTⅠ型預(yù)裝柱
● 上樣量：36.9mg/ml；線性流速120cm/h
● 平衡液：5mM PB PH6.8；
● 洗脫液：5mM PB+1M NaCl PH6.8
圖4：層析圖譜
圖5：HPLC 檢測(cè)圖
CASE 2 CHT 用于重組類因子的純化
CHT 用于重組類因子的純化，純度可達(dá)94%。某重組因子項(xiàng)目，與進(jìn)口友商進(jìn)行性能對(duì)比。
● 產(chǎn)品：BaronCHT Type I,40μm
圖6：百林科CHT I型與進(jìn)口友商性能對(duì)比
通過(guò)分析，收率、純度及質(zhì)量與進(jìn)口友商處于同一水平。
表1：百林科與進(jìn)口友商數(shù)據(jù)對(duì)比
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