在診斷和治療領(lǐng)域，需要能夠耐受復(fù)雜環(huán)境(如高有機溶劑、高鹽、酸或堿)的抗體。兔源單克隆抗體(RmAbs)因其高親和力和高穩(wěn)定性而備受青睞，但傳統(tǒng)針對小分子靶點的研發(fā)平臺效能受限。
氯霉素(CAP)是一種抗菌劑，存在于動物源性食品中的CAP會對公共健康構(gòu)成巨大威脅。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物源性食品安全檢測北京重點實驗室的王戰(zhàn)輝團(tuán)隊于2022年發(fā)表在Analyst上的文章[1]，利用基于納米孔的間接競爭性篩選利器(CSMN)僅20.6小時就獲得了靶向CAP的兔源單克隆抗體分泌細(xì)胞(ASC)。結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，該團(tuán)隊首次在5.8天內(nèi)獲得了一個靶向CAP的RmAb。該抗體檢測真實生物樣品中的CAP時，樣本前處理更簡單，并具有更短的檢測時間、更好的重復(fù)性和更高的靈敏度。
實驗設(shè)計
與靶點是蛋白的抗原不同，CAP非常小，需要與BSA耦聯(lián)后作為免疫原免疫動物，但耦聯(lián)后除了CAP，連接子(linker)和BSA也有對應(yīng)的抗體產(chǎn)生。為了得到特異性靶向CAP的抗體，利用下圖所示的CSMN平臺篩選特異性靶向CAP的ASC。
圖1. 展示獲得靶向CAP的RmAb的整個流程
• 預(yù)先用CAP-BSA包被納米孔板表面12h
• 加入分離的脾細(xì)胞與PE標(biāo)記的兔二抗混合液，靜置10min使ASCs沉降到納米孔里達(dá)到分離ASCs的目的
• 該納米孔板置于37度、5% 二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)，ASCs會分泌抗體，與包被在納米孔表面的CAP-BSA結(jié)合，再與懸液中PE標(biāo)記的二抗結(jié)合產(chǎn)生熒光信號。4h后如在納米孔內(nèi)檢測到增強的熒光信號，說明孔內(nèi)有靶向CAP-BSA的ASC
• 4h時向孔內(nèi)加入CAP，會與納米孔表面CAP-BSA中的CAP競爭分泌的抗體，如4-8h熒光信號顯著下降，則該納米孔內(nèi)的ASC是CAP特異性的ASC，如4h后信號仍很強則是靶向連接子或BSA的ASC
• 最后使用CellCelector全自動無損細(xì)胞分離系統(tǒng)結(jié)合直徑為20μm的玻璃毛細(xì)管輕柔地將該ASC挑出，裂解后分離其mRNA先反轉(zhuǎn)錄，利用特定的引物擴增RmAb的輕、重鏈可變區(qū)，測序，真核表達(dá)得到靶向CAP的RmAb
從利用納米孔板使ASCs分離為單個ASC，到連續(xù)成像追蹤抗體的分泌，最后以抗體熒光信號改變作為篩選條件，把靶向CAP的ASC挑取出來，整個流程均由CellCelector一臺設(shè)備在20.6小時內(nèi)完成，充分體現(xiàn)了CellCelector的全能和高效。
圖2. 三種不同ASCs明場采集的圖片及0-8h RmAbs熒光信號的圖片及對應(yīng)熒光強度定量結(jié)果：(圖2A)展示了納米孔中靶向CAP的單個ASC細(xì)胞明場圖片，在檢測的0-8h內(nèi)各時間點孔內(nèi)分泌的RmAbs熒光信號變化；(圖2D)4h加入的CAP前后因競爭使孔內(nèi)熒光信號降低的模式圖，以及各時間點熒光信號強度的統(tǒng)計圖，先上升后下降(2E)；靶向BSA的ASC分泌的RmAbs會持續(xù)增強(圖2B、F和G)，不靶向CAP或BSA的ASC檢測不到抗體信號(圖2C、H和I)
納米孔單細(xì)胞分離條件優(yōu)化
圖3. 納米孔尺寸及接種的細(xì)胞密度對單細(xì)胞率的影響
CellCelector提供適用于不同目的的納米孔板，每個納米孔板含有十萬到數(shù)百萬個納米孔。由于兔脾細(xì)胞直徑約為8-13μm，為確保更高的單細(xì)胞率和挑取率，實驗前測試了不同納米孔尺寸(20μm到100μm)的四種納米孔板(六邊形的H100、UFO形的U40、UFO形的U25和方形的SIEVEWELL)的單細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)U25的單細(xì)胞率最高(圖2A)。對于U25納米孔，每孔接種的細(xì)胞數(shù)也需要優(yōu)化，圖2C-E每孔細(xì)胞數(shù)依次為5E3、1E4和2E4，細(xì)胞數(shù)越多，空孔率越低，但每個納米孔含多個細(xì)胞的比例增加，1E4密度更合適。
目標(biāo)樣品的挑取
CellCelector提供各種直徑的挑頭，用于挑取不同大小的貼壁或者非貼壁細(xì)胞，也可以快速挑取在半固體中培養(yǎng)的菌落和類器官等樣本。
圖4. 靶向CAP的單個ASC細(xì)胞挑取前后采集的圖片
在挑取前，根據(jù)納米孔內(nèi)明場圖片確認(rèn)是否為單個ASC。然后，依據(jù)分泌抗體熒光信號的變化確定靶向CAP的ASC，進(jìn)而進(jìn)行挑取。挑取后，再次對該納米孔成像(紅線圈選區(qū)域)，CellCelector利用其成像功能為篩選全流程的準(zhǔn)確度保駕護(hù)航。
“屢試不爽”
下圖是王老師團(tuán)隊同年發(fā)表在《Food and Chemical Toxicology》上的成果[2]，同樣利用CSMN平臺篩選靶向另外一個與食品安全有關(guān)的小分子——瘦肉精(RAC)，圖中A、B、C分別展示了靶向RAC、BSA以及其他靶點的ASC在加入RAC前后各時間點納米孔內(nèi)分泌的抗體熒光信號的動態(tài)變化，最終篩選得到的RAC特異性RmAb可以在高尿素環(huán)境里檢測RAC的水平。
圖5.利用CSMN平臺篩選靶向瘦肉精RAC的ASC結(jié)果
一年兩篇文章利用CellCelector 高效篩選到靶向兩個小分子的RmAb，是因為CellCelector具有以下優(yōu)勢：
• 一機全能，集分離、成像和挑取為一體
• Nanowell納米孔板技術(shù)，每個納米板含有十萬到數(shù)百萬個納米孔，實現(xiàn)更高通量的細(xì)胞篩選
• 納米孔板表面可根據(jù)檢測目的進(jìn)行各種修飾，滿足多樣化篩選需求
• 支持全板掃描，每次挑取僅需20-30s，實驗操作時間短，自動化程度高
• 用于自動調(diào)整毛細(xì)管高度的SurePick™ 技術(shù)，在挑選過程中對毛細(xì)管高度進(jìn)行動態(tài)調(diào)整，允許從高度不同或半固體體系中進(jìn)行高效的全自動挑選
• 全流程存檔記錄及質(zhì)量控制，完全自動化的質(zhì)量控制過程，包括揀選前后的圖像、揀選/失敗報告和數(shù)據(jù)/圖像輸出
• 挑取對象廣，適用于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞或半固體培養(yǎng)基中的細(xì)胞、菌落以3D細(xì)胞團(tuán)的挑取
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