各種層析方法層出不窮，令廣大生物工藝工程師們眼花繚亂。本文將就如何選擇層析方法提供相關(guān)指導(dǎo)，幫助用戶選擇更適合您應(yīng)用的層析介質(zhì)。
進(jìn)行層析操作時(shí)，用戶往往需要做出一系列重要決策。即使僅有一種層析介質(zhì)(如傳統(tǒng)填料)，用戶也可采用多種不同類型的層析填料將寶貴的目標(biāo)產(chǎn)物與污染物和雜質(zhì)分離開來。更何況目前已有多種層析介質(zhì)類型可選。用戶面臨的選擇愈發(fā)多樣，搭配靈活性也不斷提升，要選出適合相關(guān)應(yīng)用的最佳組合十分困難。
盡管很具挑戰(zhàn)性，但我們?nèi)钥山柚罅繑?shù)據(jù)和信息做出符合科學(xué)原理和科學(xué)證據(jù)的決定。之前，我們探討過了解目標(biāo)產(chǎn)物和需要去除雜質(zhì)的特性至關(guān)重要，并介紹了電荷、疏水性和配體結(jié)合親和力等特性對(duì)分離效果的影響。我們可以利用這些特性來選擇適合相關(guān)應(yīng)用的層析方式，但不同的層析介質(zhì)之間又該如何選擇呢？
目前共有三種層析介質(zhì)可供選擇，用戶很可能已對(duì)其中一種十分了解。這種了解和過往使用經(jīng)驗(yàn)對(duì)決策影響巨大，往往能夠表明用戶使用該介質(zhì)時(shí)已經(jīng)獲得長(zhǎng)期成功和穩(wěn)健工藝，經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)。但當(dāng)新機(jī)會(huì)出現(xiàn)時(shí)，明智之舉是重新審視層析流程，并確認(rèn)新產(chǎn)品是否足夠出色，值得我們重新審視流程甚至替換舊產(chǎn)品。
在此，我們將詳細(xì)介紹以下三種層析介質(zhì)的不同特性：整體柱、傳統(tǒng)填料和膜層析。希望大家能夠從中掌握所需信息，在完全知情的情況下做出決策。
樹 脂
樹脂可以說是經(jīng)典的層析介質(zhì)，是檢驗(yàn)新型層析介質(zhì)的有用基準(zhǔn)。盡管已問世多年，但層析填料仍然是目前眾多分離工藝中的重要工具。
圖 1——樹脂層析法利用填裝進(jìn)層析柱中的小顆粒樹脂進(jìn)行分離。小顆粒樹脂具有特殊的化學(xué)特性，可為目標(biāo)分子(藍(lán)綠色)或雜質(zhì)(粉色)提供結(jié)合位點(diǎn)(黃色)。
也正由于傳統(tǒng)樹脂填料已經(jīng)上市相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，因此市面上生產(chǎn)廠家眾多，產(chǎn)品也極其多樣。其主干結(jié)構(gòu)可由不同材料制成，也可適用于不同分離模式——離子交換層析(IEX)、親和層析(AC)、疏水層析(HIC)和混合模式層析(MMC)常常都會(huì)用到樹脂。用戶可購買散裝樹脂，再小心將其填充進(jìn)合適尺寸和規(guī)格的層析柱中，最后根據(jù)樹脂特性用其分離不同的生物分子。用戶也可購買預(yù)填充的即用型層析柱，廣泛適用于從小型分析儀至中等規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)行等不同規(guī)模。
填料顆粒的關(guān)鍵特征之一是包含微孔結(jié)構(gòu)，結(jié)合位點(diǎn)便位于其中。這意味著溶質(zhì)分子必須由液相擴(kuò)散進(jìn)微孔中，才能發(fā)生結(jié)合。這一過程會(huì)降低分離速度，因?yàn)榉肿訑U(kuò)散總會(huì)受到限制，而且有效擴(kuò)散需要在低流速下才能實(shí)現(xiàn)。
同時(shí)，微孔尺寸較小，無法結(jié)合非常大的分子和大顆粒。就大多數(shù)樹脂而言，如分子大小超過 IgM(如 mRNA、質(zhì)粒 DNA、病毒載體和外泌體等)，則只能擴(kuò)散進(jìn)一小部分微孔中的結(jié)合位點(diǎn)。而小于單克隆抗體的任何分子，其最大結(jié)合載量往往很高。
時(shí)至今日，傳統(tǒng)填料已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的生物分子純化基質(zhì)，涵蓋從實(shí)驗(yàn)室到重大新藥級(jí)生產(chǎn)的各種規(guī)模。其在單克隆抗體純化等眾多生物工藝中的應(yīng)用已相當(dāng)成熟。
整 體 柱
整體柱相對(duì)較新，其特點(diǎn)與傳統(tǒng)填料區(qū)別顯著。整體柱是由一整塊聚合物制成的空心圓柱體，中間布滿相互連接的通道。進(jìn)行層析的官能團(tuán)分布在互連通道的壁表面。與樹脂不同，整體柱沒有微孔結(jié)構(gòu)，意味著質(zhì)量傳遞不會(huì)受到擴(kuò)散限制。相反，大量洗脫液可以攜帶待分離的分子、顆?；蚰遗萘鹘?jīng)通道，而質(zhì)量傳遞僅通過對(duì)流實(shí)現(xiàn)。
圖 2——整體柱層析法利用包含大量互連通道的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離?；ミB通道可為目標(biāo)分子(藍(lán)綠色)或雜質(zhì)(粉色)提供結(jié)合位點(diǎn)(黃色)。
目標(biāo)分子過大是考慮使用整體柱的首要因素之一，因?yàn)槭褂脴渲瑢游龃蠓肿訒?huì)導(dǎo)致擴(kuò)散速度過慢，甚至無法進(jìn)入填料顆粒的微孔中。而使用整體柱層析大分子則會(huì)大幅提高吸附效率，形成陡峭的流穿曲線并實(shí)現(xiàn)較高的結(jié)合載量。
整體柱層析與通過基質(zhì)的流速無關(guān)，分離速度通常較樹脂顯著提高，有利于加快工藝速度并提高生產(chǎn)效率。不僅如此，整體柱也可用于快速去除腐蝕性雜質(zhì)，此類雜質(zhì)如與目標(biāo)分子接觸過久則可能破壞目標(biāo)分子。
整體柱的另一大有用特性是通過層析床的流動(dòng)方式主要為層流，可為對(duì)剪切應(yīng)力特別敏感的 mRNA 等分子提供更加溫和的層析條件。整體柱中的層流與層析填料填充床中的湍流形成鮮明對(duì)比。湍流，尤其是在高流速下形成的湍流，會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力，從而破壞對(duì)剪切力敏感的分子。
除此之外，整體柱層析由于背壓較低，特別適合分離高粘性原料。隨著強(qiáng)化工藝的趨勢(shì)日益流行，這一優(yōu)勢(shì)會(huì)變得越來越有價(jià)值。
整體柱適用于多種層析方法，包括 IEX、AC(如搭配 oligo dT 配)、HIC 和 MMC。產(chǎn)品通過即買即用型整體交付，大小不等，適用于研發(fā)實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)。
膜 層 析
膜層析使用多層多孔膜進(jìn)行分離，結(jié)合位點(diǎn)位于膜孔內(nèi)。排列在膜堆中的膜孔攜帶流動(dòng)相，即質(zhì)量傳遞為對(duì)流方式。
圖 3——膜層析法依靠多孔膜堆疊實(shí)現(xiàn)。膜孔中包含目標(biāo)分子(藍(lán)綠色)或雜質(zhì)(粉色)的結(jié)合位點(diǎn)(黃色)。
膜層析的特點(diǎn)是速度快。膜堆厚度可選，以切實(shí)優(yōu)化并實(shí)現(xiàn)快速分離。使用膜層析可以高流速實(shí)現(xiàn)大量進(jìn)料。
除此之外，由于膜結(jié)構(gòu)中的結(jié)合位點(diǎn)分布廣泛且易于進(jìn)入，因此膜層析法的分離效率十分出色。而對(duì)流傳質(zhì)也不會(huì)因擴(kuò)散緩慢而形成時(shí)間限制。
快速分離對(duì)暴露于酶分解或其他破壞條件下的分子尤為有用。此類分子需要快速分離并轉(zhuǎn)移至適合的非破壞環(huán)境中。使用膜層析法可降低目標(biāo)分子在分離過程中被破壞的風(fēng)險(xiǎn)。
膜層析法擁有針對(duì) IEX、耐鹽 IEX 或 HIC的結(jié)合位點(diǎn)。層析膜也是即拆即用、無需裝填，具有囊式和卡盒式多種規(guī)格可選，使用靈活，可輕松適應(yīng)各種不同工藝。
膜孔徑大，因此層析膜特別適合分離囊泡、病毒等大顆粒。但采用結(jié)合-洗脫模式分離蛋白質(zhì)等小分子時(shí)，使用膜層析法很難達(dá)到高結(jié)合載量。相反，層析膜常被用于在工藝后期通過流穿方式去除雜質(zhì)。此時(shí)層析膜可以結(jié)合最后的少量雜質(zhì)，并讓目標(biāo)產(chǎn)物直接流過而不與結(jié)合位點(diǎn)相互作用。
在生物制造領(lǐng)域，膜層析法被廣泛應(yīng)用于在流穿模式下去除痕量雜質(zhì)和污染物，在去除內(nèi)毒素、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA 和病毒污染物等方面已相當(dāng)成熟。在結(jié)合-洗脫模式下，使用膜基質(zhì)純化病毒和核酸極其有效。
關(guān)于層析基質(zhì)的最終選擇
選擇層析基質(zhì)和分離模式不是非此即彼，即使有時(shí)會(huì)感覺選擇了其中一種便放棄了其他所有。真實(shí)的純化工藝通常比較復(fù)雜，需要進(jìn)行多輪層析。在這種情況下，可能需要混合搭配不同層析基質(zhì)和分離方法，才能確保在工藝流程的每個(gè)階段都獲得最佳結(jié)果。
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