1、補體細胞毒分離法
采用特異性抗細胞表面標(biāo)記的抗體,結(jié)合具有該表面標(biāo)記的細胞,在補體的作用下,使具有該表面標(biāo)記的細胞發(fā)生溶解,將其從混合細胞群體中去除。
2、免疫磁珠分離法
磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子(如Fe3O4)為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒,即磁性微珠。在液相中,受外加磁場的吸引作用,磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體,包被上針對某種細胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。
免疫磁性微珠主要用于細胞的分離和純化,其基本原理及步驟是:首先將抗特異細胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上,待它與混合體系中的細胞反應(yīng)后,利用磁力的作用,使與致敏結(jié)合的細胞與其它物質(zhì)分離,達到純化、分離的目的。通常有二種分離方式:陽性分離和陰性分離。陽性分離是直接從細胞混合液中分離出靶細胞,陰性分離是利用磁珠去除無關(guān)細胞,使靶細胞得以分離。
免疫磁珠分離細胞方法簡便,快速,無需特殊的設(shè)備,且分離純度高,產(chǎn)率大,近年來已被廣泛應(yīng)用于人類各種細胞的分離,如T、B淋巴細胞、內(nèi)皮細胞、造血祖細胞、單核/巨噬細胞及胰島細胞、多種腫瘤細胞等。
近年來,人們又開發(fā)出與生物素結(jié)合的單抗-親和素/鏈霉親和素-生物素結(jié)合的磁性微珠的實驗方法,這種方法旨在利用生物素-親和素間的高親和力和生物放大作用來增強磁性微珠與細胞的結(jié)合力,從而提高細胞的分離效率。為了對細胞分離效果迅速進行分析,可將熒光素標(biāo)記(如FITC)標(biāo)記在親和素/鏈霉親合素表面,使所分離的細胞在流式細胞儀(FCM)上立即得到測定分析,從而省去了免疫熒光染色的時間。
目前,實驗室針對此種細胞分離技術(shù)的常用儀器是磁性激活細胞分離器(magnetic activated cell sorter,MACS)。此裝置有一個強有力的*性磁鐵、幾個具有不同分離容量的含磁鐵基質(zhì)的分離柱(B1型可分離5×107細胞,柱體積2.8ml;B2型可分離1×108細胞,柱體積4ml;C型可分離2×108細胞,柱體積8ml)和生物素標(biāo)記的磁珠組成,磁珠直徑為50~150mm。分離柱在使用前以高壓滅菌。
3、流式細胞術(shù)
流式細胞儀由激光光源系統(tǒng),氣控單細胞層流系統(tǒng),光檢測及信息處理系統(tǒng)和細胞分離純化系統(tǒng)組成。
其工作原理及特點為經(jīng)過熒光抗體染色的單細胞懸液和鞘液在氮氣壓力下同時進行流室,形式鞘液包裹細胞懸液的穩(wěn)定層流,由噴嘴高速射下(1000~5000個細胞/s),與垂直而來的激光束交匯。在混合細胞中,由于細胞大小、胞內(nèi)顆粒多少及DNA含量等不同,使激光產(chǎn)生不同的散射,分別由散射光檢測器接受;細胞上著染的熒光染料在激發(fā)光激發(fā)下,發(fā)射出熒光,由熒光檢測器接受,所有信號自動傳入電子計算機分析處理,迅速獲得細胞類群及其數(shù)量的信息。由高頻超聲振蕩器和極向偏轉(zhuǎn)板等構(gòu)成的細胞分離純化系統(tǒng),在分析鑒別不同的細胞類群的基礎(chǔ)上,使帶有不同電荷的細胞滴通過電磁場時發(fā)生偏離,zui后將細胞分別收集于不同容器內(nèi)。
流式細胞術(shù)(FCM)是一種對處在液流中的單個細胞或其它生物微粒(如細菌)等進行快速定量分析和分選的技術(shù),它將免疫熒光與細胞生物學(xué)、流體力學(xué)、光學(xué)和電子計算機等多種學(xué)科的*融為一體,進行細胞和分子水平的基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究。
將熒光標(biāo)記的單克隆抗體加入PBMC懸液內(nèi),使二者特異性結(jié)合,通過流式細胞儀自動檢測,既可很快得到T、B細胞及其亞群百分率和值的有關(guān)數(shù)據(jù),又能以每秒高達5000個細胞(18×106 細胞/h)的速度分離和收集無菌的淋巴細胞,純度可達90%~99%,細胞活性亦不受影響,可用于淋巴細胞的各種免疫生物學(xué)功能測定。
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