顯微鏡超薄切片技術(shù)制作：
由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱(chēng)為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。(單筒顯微鏡)
在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是最基本、的制備技術(shù)。超薄切片的制作過(guò)程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過(guò)取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。
超薄切片主要步驟
取材、分割
固定
脫水
滲透、包埋
超薄切片
超薄切片染色
1取材、分割
1.1取材、分割的基本要求
組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，會(huì)由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生前狀態(tài)，必須做到快、小、準(zhǔn)、冷。
(1)動(dòng)作迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時(shí)間內(nèi)(爭(zhēng)取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)體積要小，一般不超過(guò)0.5mm×0.5mm×0.5mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。
(3)機(jī)械損傷要小，解剖器械應(yīng)鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。
(4)操作在低溫(0℃～4℃)下進(jìn)行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。
(5)取材部位要準(zhǔn)確
1.2取材方法：
將取出的組織放在潔凈的韌性較大的紙上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應(yīng)先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。
2固定
2.1固定的目的
是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們?cè)瓉?lái)所在的位置上。
2.2固定的方法
有物理法和化學(xué)法兩大類(lèi)。
物理法系采用冰凍、干燥等手段來(lái)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；
化學(xué)法是用一定的化學(xué)試劑來(lái)固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)通常使用化學(xué)法對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定。
2.3常用固定劑有:
(1)(OsO4)
是一種強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時(shí)間一般為1-2小時(shí)。
(2)戊二醛 (C5H8O2)
戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對(duì)組織和細(xì)胞的穿透力比強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長(zhǎng)時(shí)間的固定(幾周甚至1～2個(gè)月)不會(huì)使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒(méi)有電子染色作用，對(duì)細(xì)胞膜的顯示較差。
組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分前固定和后固定，中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時(shí)以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～
2小時(shí)，pH7.2～7.4。固定完畢，用緩沖液漂洗20分鐘后進(jìn)行脫水。
3脫水
為了保證包埋介質(zhì)*滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來(lái)取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。
急驟的脫水會(huì)引起細(xì)胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行：15% 乙醇15分鐘，30%乙醇15分鐘，50%乙醇15分鐘， 70%
乙醇15分鐘，85%乙醇15分鐘，95%乙醇15分鐘，99%乙醇10分鐘(二次)。游離細(xì)胞可適當(dāng)縮短脫水時(shí)間。過(guò)度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會(huì)使樣品發(fā)脆，造成切片困難。
4滲透和包埋
4.1滲透
滲透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑的過(guò)程，這種包埋劑在單體狀態(tài)時(shí)(聚合前)為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，并經(jīng)加溫后，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。
目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹(shù)脂(epoxyresin)。環(huán)氧樹(shù)脂是一類(lèi)高分子聚合物，它的分子中含有兩種反應(yīng)基團(tuán)，即環(huán)氧基和羥基。當(dāng)加入酸酐類(lèi)時(shí)，樹(shù)脂分子中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接，這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做硬化劑，它們參與交聯(lián)反應(yīng)，并被吸收到樹(shù)脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，簡(jiǎn)稱(chēng)DDSA)、甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，簡(jiǎn)稱(chēng)MNA)及順丁烯二酸酐等。
當(dāng)加入胺類(lèi)時(shí)，就引起末端環(huán)氧基相連，形成首尾相接的長(zhǎng)鏈狀聚合物。這種促進(jìn)末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑。常用的加速劑有2,4,6-三(二甲氨基酚)(簡(jiǎn)稱(chēng)DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺等。為了改善包埋塊的切割性能，某些環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑配方中還加有增塑劑，使包埋塊具有適當(dāng)?shù)捻g性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡(jiǎn)稱(chēng)DBP)。
4.2包埋
包埋操作：常規(guī)將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小時(shí))、60℃(24-36小時(shí))烤箱內(nèi)加溫，即可聚合硬化，形成包埋塊。
包埋操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
(1)所有試劑要防潮，存放在干燥器中；
(2)所用器皿應(yīng)烘干；
(3)配包埋劑時(shí)，每加入一種試劑要攪拌均勻；
(4)包埋時(shí)動(dòng)作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；
(5)皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；
(6)盛放過(guò)包埋劑的容器要及時(shí)用丙酮清洗干凈。
5超薄切片
5.1修塊
一般用手工對(duì)包埋塊進(jìn)行修整。將包埋塊夾在特制的修塊器上或拿在手中，在明亮處或放在解剖鏡下，用什錦銼或鋒利的刀片先銼或削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。
5.2半薄切片定位
利用超薄切片機(jī)切厚度為1μm-10μm的切片，稱(chēng)厚切片或半薄切片。將切下的片子用鑷子或吸管轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察定位。
半薄切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察的目的：(微生物顯微鏡)
(1)定位：通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。
(2)便于對(duì)同一組織的同一部位進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對(duì)比觀察。半薄切片定位以后，要對(duì)包埋塊作進(jìn)一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長(zhǎng)方形，每邊的長(zhǎng)度為0.2mm～0.3mm。
5.3制刀超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價(jià)格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，厚度為5mm～6.5mm。
玻璃刀用制刀機(jī)制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有塑料水槽和膠布水槽兩種。塑料水槽有固定的形狀，可反復(fù)使用。膠布水槽是臨時(shí)用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。
5.4載網(wǎng)和支持膜.(1) 載網(wǎng)
電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網(wǎng)孔的數(shù)目不等，有100、200、300目等多種規(guī)格，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
(2)支持膜的制備
挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱(chēng)支持膜，厚度為10nm～20nm。對(duì)支持膜的要求是透明無(wú)結(jié)構(gòu)，并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及縮甲醛膜(formvar膜)，一般采用后者。
5.5超薄切片機(jī)
超薄切片需用超薄切片機(jī)進(jìn)行。
5.5.1超薄切片機(jī)分類(lèi)
根據(jù)推進(jìn)原理不同，將超薄切片機(jī)分為兩大類(lèi)：
(1)機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)，用微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來(lái)提供微小推進(jìn)；
(2)熱脹冷縮式切片機(jī)，利用金屬桿熱脹或冷縮時(shí)產(chǎn)生的微小長(zhǎng)度變化來(lái)提供推進(jìn)。
5.5.2超薄切片的步驟包括：(金相顯微鏡)
(1)安裝包埋塊；
(2)安裝玻璃刀；
(3)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；
(4)預(yù)切片；
(5)換切片刀重新調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；
(6)水槽液面高度與燈光位置；
(7)調(diào)節(jié)切片厚度及切片速度，切片；
(8)將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。
5.5.3超薄切片厚度的判斷
干涉色厚度
暗灰色<40nm
灰色40nm～50nm
銀色50nm～70nm
金色70nm～90nm
紫色80nm～150nm
6超薄切片的染色
未經(jīng)染色的超薄切片，反差很弱。因此，要進(jìn)行染色處理，以增強(qiáng)樣品的反差。
一般是用重金屬鹽與組織細(xì)胞中某些成分結(jié)合或被組織吸附來(lái)達(dá)到染色的目的。重金屬的原子對(duì)電子束形成散射，從而提高圖象的反差。
常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法有兩種：
(1)組織塊染色
在脫水至70%乙醇時(shí)，將組織塊放在用70%乙醇配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時(shí)間2小時(shí)以上，或在冰箱中過(guò)夜。
(2)切片染色(生物顯微鏡)
預(yù)先取一個(gè)清潔的培養(yǎng)皿，將石蠟溶解制作成蠟板，然后滴數(shù)滴染液于蠟板上，用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿，染色10～20分鐘。載網(wǎng)從染液中取出后，必須盡快用蒸餾水清洗干凈。
在染色過(guò)程中，鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成碳酸鉛顆粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液時(shí)，要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉淀污染，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放置氫氧化鈉顆粒，以吸收空氣中的二氧化碳。
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