一、支原體污染檢測

1.     支原體檢測方法概述

支原體污染嚴(yán)重干擾細(xì)胞實驗結(jié)果，檢測有無支原體污染的方法較多，可以根據(jù)自身實驗室條件、檢測方法便捷性等作出選擇。

= 1 \* GB3 ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察。用掃描電鏡或透射電鏡，直觀觀察支原體形態(tài)?；蛘咴诩?xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)置蓋玻片，接種細(xì)胞在蓋玻片上，培養(yǎng)24小時后取出用油鏡觀察。如有支原體，因支原體與細(xì)胞在不同平面，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝。缺點：設(shè)備要求嚴(yán)格，檢測成本高，不適合普通實驗室日常常規(guī)檢測。

= 3 \* GB3 ③DNA熒光染色法，利用支原體沒有細(xì)胞膜（壁）的特性，用熒光染料Hoechst 33258染色， Hoechst 33258能與支原體DNA結(jié)合著色，在熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)綠色小點。缺點：靈敏度太低，當(dāng)檢測成陽性時，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。

= 4 \* GB3 ④培養(yǎng)法，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體，是相對可靠的支原體檢測技術(shù)。缺點：耗時長，需要數(shù)周時間才能得到結(jié)果，不適合作為細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。此外，該方法不能檢測豬鼻支原體，因為豬鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%。

= 5 \* GB3 ⑤PCR法，提取細(xì)胞培養(yǎng)液，提取支原體，制備樣品，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設(shè)計引物（避免真核細(xì)胞或細(xì)菌DNA干擾），設(shè)置陰性，陽性對照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察，可識別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體。

= 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速檢測法，拓?fù)涿腑h(huán)化支原體DNA，在根據(jù)高保守區(qū)設(shè)計的引物引導(dǎo)下，采用特殊等溫DNA擴(kuò)增酶，61℃條件下，連續(xù)滾環(huán)式擴(kuò)增支原體DNA 60分鐘，根據(jù)有無支原體污染，隨著擴(kuò)增進(jìn)程可目視實驗結(jié)果。

= 7 \* GB3 ⑦化學(xué)發(fā)光法，裂解支原體后，有底物情況下，支原體特異性的酶，能將ADP轉(zhuǎn)化成ATP。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過程，所以可以通過催化底物熒光素導(dǎo)致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號來判別支原體DNA存在與否。

綜上所述，在多種支原體檢測方法中，受實驗條件、實驗時長、便捷性等因素限制， = 1 \* GB3 ①- = 4 \* GB3 ④僅在很少情況下得到應(yīng)用。實際科研工作中，應(yīng)用的是 = 5 \* GB3 ⑤ PCR支原體檢測法； = 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速支原體檢測法； = 7 \* GB3 ⑦化學(xué)發(fā)光支原體檢測法。

2.     幾種zui常用支原體檢測方法比較

檢測方法	Quick Cell快速檢測法	化學(xué)發(fā)光法	PCR法
檢測原理	環(huán)化DNA等溫連續(xù)擴(kuò)增	支原體特異性酶檢測	根據(jù)支原體DNA序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
實驗條件	恒溫水浴或PCR儀	-80℃超低溫冰箱，多功能酶標(biāo)儀或發(fā)光檢測儀	常規(guī)PCR儀，電泳儀，成像系統(tǒng)
靈敏度	比PCR法高1-2個數(shù)量級	與PCR法相當(dāng)	較靈敏
檢測時長	1小時	25分鐘	2-3小時
定性/定量	定性	定性，半定量	定性，半定量
污染 假陽性率	低	低	高
引物 假陽性率	零	零	高
樣品制備	直接取上清，不需制備	需要樣品制備	離心
檢出 正確率	>99%	>99.9%	>80%
綜合評價	1）簡便、快速，任何實驗室均可操作；2）擴(kuò)增不受細(xì)胞代謝產(chǎn)物影響，高準(zhǔn)確率	1）快速，準(zhǔn)確；2）有特定設(shè)備要求，物流儲存條件高。	1）較高的檢出準(zhǔn)確率；2）PCR反應(yīng)易受培養(yǎng)基成分抑制，產(chǎn)生假陰性；3）需制備樣品。
代表性 產(chǎn)品	Quick Cell 快速支原體檢測（李記生物, CAT:C4056L1060） *本產(chǎn)品由細(xì)胞專家李記生物*研發(fā)	Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（李記生物,CAT:C4056L1065） MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (Lonza, CAT: LT07-710)	Quick Cell 支原體PCR檢測試劑盒（李記生物,貨號: C4056L1062） Lookout Mycoplasma Detection Kit.（Sigma貨號:MP0035）

3.     支原體檢測策略及方法選擇

①單個方法獨立檢測支原體（正確檢出率80%-99.9%）

就單個檢測方法及原理而言，“化學(xué)發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%），用時zui短，應(yīng)為方法。可選產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價格：約9800元/100次），或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（CAT:C4056L1065，價格：1250元/50次）”。

若受實驗室條件所限沒有配備化學(xué)發(fā)光檢測儀，或多功能酶標(biāo)儀，建議選擇“Quick Cell快速檢測法”，該方法1小時出結(jié)果，避免了PCR法因細(xì)胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應(yīng)導(dǎo)致的假陰性出現(xiàn)，正確檢出率大于99%，對設(shè)備幾乎無要求，可目測結(jié)果。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（CAT:C4056L1060，價格：1250元/50次）”。

 ②多原理支原體檢測策略

市場在售的所有支原體檢測試劑盒，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細(xì)胞治療、進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)、生產(chǎn)血清、胰酶、培養(yǎng)液工作的科研人員，強(qiáng)烈建議選擇兩種以上檢測方法，確保支原體正確檢出率達(dá)到*，避免關(guān)鍵實驗不必要的損失。

細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染是個普遍性問題，污染來源很多，根據(jù)國外生物實驗室的規(guī)范做法，實驗室的支原體檢測要定期進(jìn)行，一般一個月做一次支原體檢測，可以*時間確定支原體污染情況，顯著降低或避免支原體污染對細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實驗的影響。

二、支原體污染去除

1.     支原體污染預(yù)防

根據(jù)可能的支原體污染來源，在體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中，要嚴(yán)格控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實驗操作；細(xì)胞培養(yǎng)基和實驗器材、耗材要保證無菌；在不影響實驗結(jié)果的前提下，可在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素；發(fā)現(xiàn)支原體污染后，要清除支原體，防微杜漸。

2.     支原體污染的去除及預(yù)防

因為支原體沒有細(xì)胞壁，一般用于細(xì)胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用，如青霉素、萬古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時，這些抗生素不會產(chǎn)生耐藥性，且對哺乳動物細(xì)胞的毒性較小。四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯能結(jié)合30S和50S核糖體亞基，從而抑制支原體蛋白質(zhì)合成，喹諾酮抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶。因此可以在細(xì)菌DNA復(fù)制及蛋白質(zhì)合成兩個層面上抑制細(xì)菌生長，明顯增強(qiáng)除菌效果。

3.      支原體去除試劑選擇

選擇支原體去除試劑需要注意幾個關(guān)鍵幾點： ①細(xì)胞毒性小，毒性大的試劑在去除支原體的同時，會殺死細(xì)胞；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑，去除多種支原體，以及細(xì)菌，真菌等； ③操作簡便，沒有二次污染；要考慮操作使用是否方便，因為如果使用起來比較麻煩，首先是費時費力，另外可能會帶來二次污染。目前市場上有多種支原體去除&預(yù)防試劑可選。包括李記生物的Quick Cell支原體預(yù)防/去除試劑，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin，羅氏公司的BM-Cyclin，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

 Quick Cell支原體預(yù)防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯(lián)合使用兩種成分，分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染，細(xì)胞毒性更小。作用周期1-2周，支原體去除率大于92%。去除預(yù)防兼顧

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分，抑制支原體及細(xì)菌生長，去除培養(yǎng)細(xì)胞中已感染的支原體。適用于多種培養(yǎng)細(xì)胞，無明顯副作用，又不影響細(xì)胞本身的代謝，而且處理過的細(xì)胞不會重新感染支原體。BM-Cyclin需聯(lián)合使用，作用周期2周，可消除80%以上的支原體。不確定能否預(yù)防。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素，四環(huán)素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上，可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星，屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感，需要根據(jù)支原體種類使用。處理周期2周，能去除90%的支原體。是否可以預(yù)防支原體目前還不能確定。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物，包含兩個針對支原體的有效成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制階段，對許多細(xì)菌和真核細(xì)胞則沒有影響。作用周期2周，去除效率未知。有兩個濃度包裝，去除用高濃度，預(yù)防用低濃度。