本應(yīng)用介紹了使用 ibidi µ-Slide 18 孔載玻片培養(yǎng)，固定和染色貼壁細(xì)胞的簡(jiǎn)單方案。在此示例中，我們培養(yǎng)了人內(nèi)皮細(xì)胞，用 paraformaldehyde 固定了它們，并對(duì) F-actin 細(xì)胞骨架和表達(dá)α- 微管蛋白的微管進(jìn)行了染色。細(xì)胞核用 DAPI 復(fù)染。

該應(yīng)用四個(gè)主要步驟：

在本應(yīng)用中，使用了以下材料：

材料	制造商	目錄編號(hào)
µ-Slide 18 孔載玻片 ibiTreat	伊比迪	81816
胡韋克	各種	各種
4％paraformaldehyde	西格瑪奧德里奇	HT5011
0.1％Triton®X-100（在 PBS 中稀釋）	阿爾法·埃薩（Alfa Aesar）	A16046
1％ 牛血清白蛋白（在 PBS 中稀釋）	西格瑪奧德里奇	A1470
LifeAct-TagGFP2 蛋白	伊比迪	60112
單克隆抗 α-Tubulin 抗體，小鼠	西格瑪奧德里奇	T5168
抗小鼠 IgG-Atto594	西格瑪奧德里奇	76085
具有 DAPI 的 ibidi 安裝介質(zhì)	伊比迪	50011
可選：ibidi 浸油	伊比迪	50101

熒光顯微鏡（倒置），帶有合適的濾光片組

1. 播種

· 在無(wú)菌條件下打開(kāi) ibidi µ-Slide 18 孔載玻片 ibiTreat（＃81816）的包裝，并將其放在 µ-Slide 機(jī)架（ibidi＃80003）上。

· 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液（1 x 105 細(xì)胞/ ml），并在 µ-Slide 18 孔載玻片每個(gè)孔中加入 100 µl。

· 用提供的蓋子蓋上腔室。

· 在潮濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱（37°C，5％CO2）中培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)于更長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)，我們建議幾天后進(jìn)行中等程度的交換。

2. 固定，滲透和封閉

· 使用細(xì)胞培養(yǎng)抽吸裝置從孔中抽吸細(xì)胞培養(yǎng)基。

· 用 Dulbecco PBS 沖洗細(xì)胞，方法是將 100 µl 緩慢加入每個(gè)孔。

· 用約 100 µl 4％paraformaldehyde 固定細(xì)胞 20 分鐘。

· 用 PBS 沖洗細(xì)胞兩次，方法是將 100 µl 緩慢加入每個(gè)孔中。

· 除去液體，并在 PBS 中加入約 100 µl 的 0.1％Triton®X-100。孵育 10 分鐘。

· 用 PBS 洗滌細(xì)胞,緩慢將 100 µl 加入每個(gè)孔中。

· 除去液體，并在 PBS 中加入 100 µl 1％BSA 封閉溶液。孵育 20 分鐘。

· 用 PBS 洗滌細(xì)胞,緩慢將 100 µl 加入每個(gè)孔中。

3. 染色

· 準(zhǔn)備您的染色和抗體溶液。

· 使用細(xì)胞培養(yǎng)抽吸裝置從孔中除去液體。

· 將 100μl 用 PBS 稀釋的一抗（抗-Tubulin 1：1000）稀釋到每個(gè)孔中，并在 4°C 下孵育過(guò)夜。

· 用 PBS 洗滌細(xì)胞一次，持續(xù) 10 分鐘。

· 將在 PBS 中稀釋的 100 µl 二級(jí)抗體混合物（抗小鼠 IgG-Atto594 1：500 和 LifeAct-TagGFP2 蛋白 30 µg / ml）稀釋到每個(gè)孔中，并在室溫下于黑暗中孵育 3 小時(shí)。

· 用 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次 10 分鐘。

· 吸出 PBS，并在每個(gè)孔中加入約 100 µl 含 DAPI 的 ibidi 封固劑。使用滴管瓶滴加安裝介質(zhì)。

4. 顯微鏡觀察

· 在熒光顯微鏡下用合適的濾光片組觀察細(xì)胞，并可選擇用 ibidi 浸油（＃50101）觀察細(xì)胞。

· （可選）覆蓋圖像以創(chuàng)建合并圖像。

5. 結(jié)果

接種在 µ-Slide 18 孔載玻片 ibiTreat 中，物鏡 60x，油浸后 24 小時(shí)后的 HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）。

綠色：F-肌動(dòng)蛋白（LifeAct-TagGFP2 蛋白）

紅色：微管蛋白（單克隆抗 α-Tubulin 抗體，小鼠+抗小鼠 IgG-Atto594）藍(lán)色：核仁（使用具有 DAPI 的 ibidi Mounting Medium 進(jìn)行 DAPI 染色）

在本應(yīng)用中使用的 ibidi µ-Slide 18 孔載玻片帶有 18 個(gè)孔的小室蓋玻片，用于細(xì)胞培養(yǎng)，免疫熒光和顯微鏡檢查，它具有以下特點(diǎn)：

• 多合一 18 孔腔載玻片，用的細(xì)胞數(shù)量少，試劑量少的經(jīng)濟(jì)高效實(shí)驗(yàn)
• 顯微鏡載玻片非常適合通過(guò)光學(xué)質(zhì)量的 1.5 號(hào)聚合物蓋玻片底部進(jìn)行高分辨率成像
• 適用于各種顯微鏡技術(shù)（例如 DIC，寬場(chǎng)熒光，共聚焦顯微鏡，雙光子顯微鏡，F(xiàn)RAP，F(xiàn)RET，F(xiàn)LIM和 LSFM）的細(xì)胞培養(yǎng)室