細胞間的差異存在于任何細胞群體中，此前對細胞機制的理解還依賴于對大量細胞群體的測定?，F(xiàn)在人們普遍認為，總體平均值可能不代表單個細胞功能，因此需要用單細胞分辨率來解析細胞“組學(xué)”(例如，基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等)。近來，單細胞DNA和RNA測序的發(fā)展使其能夠以單細胞分辨率監(jiān)測細胞譜系和細胞異質(zhì)性。然而，即使是等基因細胞(即具有相同基因型的細胞)也可能表現(xiàn)出隨機的細胞異質(zhì)性。代謝產(chǎn)物和其他成分濃度的非遺傳性細胞差異會影響細胞死亡易感性、動力學(xué)，甚至是對統(tǒng)一致命藥物暴露的死亡模式。在癌癥治療中，連續(xù)幾輪細胞毒性化療通常會殺死腫瘤中一定比例的細胞，而不是絕對數(shù)量的細胞，這表明要么是預(yù)先存在的細胞異質(zhì)性抑制治療，要么是細胞亞群對治療的選擇性反應(yīng)，也就是說非遺傳細胞異質(zhì)性對治療和治療的總體療效有明顯影響。
用單細胞分辨率檢測代謝物是很大的挑戰(zhàn)。在一個細胞內(nèi)，有數(shù)千種獨特的化學(xué)物質(zhì)以低濃度存在，且這些化學(xué)物質(zhì)可以迅速變化，與單細胞基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)不同，代謝物沒有可用的擴增策略，若想獲得足夠的單細胞數(shù)據(jù)以統(tǒng)計區(qū)分細胞群體或亞群體之間的差異，高靈敏度，高的單細胞采樣吞吐量是必需的。流式細胞術(shù)是常用的單細胞測定技術(shù)之一，使用基于熒光的分子探針，以很高的通量(數(shù)千個細胞/秒)分析特定代謝物，但由于光譜特征重疊，流式細胞術(shù)只能同時測定大約十幾個分子。使用基于重金屬同位素的分子探針組合，流式細胞儀可以靶向多達48個不同的分子組分，但這仍然只代表單個細胞中存在的代謝物的一小部分。不幸的是，通過流式和質(zhì)譜細胞術(shù)進行無靶向分子分析是不可行的，即研究人員必須事先知道并選擇要研究的分子。
質(zhì)譜(MS)由于其高靈敏度、化學(xué)特異性和速度是適合非靶向單細胞分析的技術(shù)之一。目前已有幾種基于真空和探針的質(zhì)譜技術(shù)，以實現(xiàn)對單細胞的全面、無靶化學(xué)分析，包括二次離子質(zhì)譜(SIMS)、基質(zhì)輔助激光/解吸電離(MALDI)和激光/解吸離子化(LDI)技術(shù)，這些技術(shù)雖然非常敏感，但需要在細胞的自然狀態(tài)之外對其進行重大修改(例如固定和脫水)，以便于在真空下進行分析。還有幾種方法，包括活單細胞質(zhì)譜、單探針質(zhì)譜和其他方法，使用手動引導(dǎo)的探針(移液器、光纖、毛細血管等)在原位或體內(nèi)通過環(huán)境質(zhì)譜測定細胞化學(xué)，然而，低采樣通量限制了大多數(shù)這些方法的使用，因為每個細胞的測定都很費時。
隨著技術(shù)的進一步發(fā)展，基于MS的技術(shù)成為快速、定量和非靶向單細胞化學(xué)分析所需技術(shù)的基礎(chǔ)。然而，單細胞化學(xué)的常規(guī)定量測定仍然具有挑戰(zhàn)性。此外，為了便于分析，目前的MS平臺需要廣泛的樣品制備程序或以其他方式干擾細胞的天然狀態(tài)，這可能會對細胞化學(xué)產(chǎn)生不可預(yù)見的影響。為了解決這些問題，此報道開發(fā)了一種新的單細胞化學(xué)分析能力，利用單細胞液滴分配，然后用常壓溶劑萃取-MS方法進行化學(xué)分析。本文證明了單細胞打印機液體渦流捕獲MS（SCP-LVC-MS）系統(tǒng)可以高采樣通量定量測定單個微藻和哺乳動物細胞的脂質(zhì)組學(xué)特征，并在分析之前不需要對細胞本身進行任何修飾。
SCP-LVC-MS技術(shù)的工作原理是通過SCP技術(shù)進行單細胞分離，然后將液滴捕獲到LVC-MS采樣探針中，一旦暴露于適當(dāng)?shù)娜軇┲?，細胞就被裂解、提取并通過MS進行分析。SCP是一種臺式自動液滴式細胞打印機，利用類似噴墨的分配原理與光學(xué)顯微鏡相結(jié)合，含有>1個或沒有細胞的液滴可以通過成像顯微鏡識別，并通過真空吸出，確保每滴噴出一個細胞，在實踐中，>95%的噴出液滴含有單個細胞。SCP系統(tǒng)放置在Sciex TripleTOF®5600+質(zhì)譜儀的頂部(圖1d)，LVC探針連接在SCP系統(tǒng)的底座上(圖1c)。cartridge在LVC探針正上方1mm處對齊(圖1c)，確保探針捕獲所有用于分析的液滴。LVC-MS是一種利用連續(xù)流動液體溶劑萃取的常壓MS技術(shù)，LVC-MS技術(shù)使用同軸管設(shè)計，當(dāng)在優(yōu)化的溶劑和噴霧器氣體條件下操作時，在探針的采樣端保持穩(wěn)定的液體渦流排放(圖1c)，與液體渦流表面接觸的分析物在幾秒鐘內(nèi)被捕獲、提取并輸送到質(zhì)譜儀的電離源。隨后，使用電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)或幾乎任何基于液體的電離源對分析物進行電離，并通過MS進行檢測。在該配置中，含有單個細胞的液滴朝著LVC探針落下，該探針位于液滴噴出部位的正下方(圖1b)，液滴被液體渦流捕獲，其中細胞在暴露于溶劑(例如甲醇、氯仿等)時，由于滲透壓的變化而破裂，細胞的內(nèi)容物在運輸?shù)劫|(zhì)譜儀的電離源(~6s)，分析物分子被離子化，然后使用MS以非靶向(例如，飛行時間(TOF)-MS)或靶向(如，串聯(lián)MS)方式進行測定。由于LVC探針是連續(xù)工作的，探針是自清潔的，去除了從一個細胞到另一個細胞的信號攜帶，并且可以容易地確定溶劑離子或由介質(zhì)引起的離子的背景測定。這種方法的獨特之處在于，細胞一直保持在其“自然”狀態(tài)(在這種情況下是在生長培養(yǎng)基中)，直到LVC-MS進行裂解和化學(xué)分析。此外，SCP-LVC-MS技術(shù)不需要分子標(biāo)記或其他樣品制備方案，質(zhì)譜儀和電離源的操作方式與通常用于測定細胞群體中細胞化學(xué)的直接注入ESI實驗的操作方式完全相同。
圖1：SCP-LVC-MS系統(tǒng)概述
為了評估SCP-LVC-MS系統(tǒng)測定單細胞化學(xué)圖譜的能力，作者使用了直徑約為5-15μm的CC-125野生型mt+[137c]ChRe微藻，在不稀釋或不對細胞懸浮液進行其他改變的情況下，將ChRe細胞懸浮液移液到SCP芯片中，放置在SCP分配器上，并調(diào)整液滴噴射設(shè)置，在1分鐘窗口內(nèi)對9個細胞取樣時的總離子色譜圖(TIC)如圖2a所示，TIC中的每個信號尖峰對應(yīng)于單個細胞的分析。該過程僅允許包含單個細胞的液滴落入LVC-MS探針中，在t=0.55分鐘時，細胞液滴噴射前后的噴嘴圖像(用“*”表示圖2a)分別如圖2b和c所示。收集同一細胞的TOF-MS以及三次SWATH-MS掃描，在TOF-MS光譜中觀察到數(shù)十個離散離子(圖2d)。圖2e-g是基于單獨的串聯(lián)質(zhì)譜實驗和SWATH-MS掃描結(jié)果，在同一細胞的SWATH-MS質(zhì)譜中可以觀察到相關(guān)分子的特征碎片離子。
圖2.ChRe微藻單細胞的SCP-LVC-MS分析
除此之外，SCP-LVC-MS技術(shù)也在其他類型細胞上得到了驗證，獲得了另外一種微藻EuGr以及HeLa細胞(源于宮頸癌癥的常用人類上皮細胞系)的單細胞質(zhì)譜。將細胞懸液直接從其培養(yǎng)基或儲存介質(zhì)(分別用于EuGr和HeLa細胞的HSM和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))移液到各自的SCP芯片中，并通過LVC探針進行采樣。除了稀釋HeLa細胞懸浮液之外，在分析之前的任何一個實驗中都沒有使用樣品制備(過濾、離心、固定等)。EuGr和HeLa實驗的TIC軌跡分別如圖3a和3b所示。EuGr細胞直徑約20μm，呈橢圓形(圖3d)，細胞的活性突出表明，它們從自然狀態(tài)一直到LVC探針捕獲點都沒有受到干擾，EuGr細胞的TOF-MS光譜如圖3g所示。單個HeLa細胞(直徑約15μm)的圖像和質(zhì)譜分別如圖3f和3h所示。
圖3.Euglena gracilis和HeLa細胞的單細胞分析
這些數(shù)據(jù)共同突出了SCP-LVC-MS系統(tǒng)測定藻類和哺乳動物細胞類型的單細胞化學(xué)的能力。該過程除了稀釋之外沒有采取額外樣品制備措施，通過對每種培養(yǎng)基的空液滴進行采樣評估，發(fā)現(xiàn)幾乎沒有產(chǎn)生細胞中測定到的脂質(zhì)信號，這表明脂質(zhì)信號來自LVC探針中裂解的細胞，也表明用于稀釋的培養(yǎng)基在該m/z范圍(700-1000)內(nèi)對單細胞質(zhì)譜的影響通?？梢院雎圆挥嫛?br />
SCP-LVC-MS系統(tǒng)的獨特之處在于，相對于其他非靶向MS單細胞方法，能夠以高采樣吞吐量以非靶向方式測定單細胞。SCP-LVC-MS系統(tǒng)的可行性通過測定微藻及HeLa細胞在其天然生長培養(yǎng)基中的脂質(zhì)組成被驗證。在單個細胞中觀察到大量的二酰基甘油基三甲基高絲氨酸(DGTS)、磷脂酰膽堿(PC)、單半乳糖基二?；视?MGDG)和二半乳糖基甘油(DGDG)脂質(zhì)。該文還進行了其他實驗以證實不同單細胞脂質(zhì)存在明顯差異以及以單細胞分辨率解決細胞群體差異的能力。
綜上，本文獻報告了一種方法，該方法通過單細胞打印機技術(shù)和液體渦流捕獲質(zhì)譜法（SCP-LVC-MS）的結(jié)合，無需額外的樣品制備程序（如分子標(biāo)記），即可對細胞懸浮液中的單細胞進行無靶向、高通量和定量質(zhì)譜分析。
參考文獻：
Cahill JF, Riba J, Kertesz V. Rapid, Untargeted Chemical Profiling of Single Cells in Their Native Environment. Anal Chem. 2019 May 7;91(9):6118-6126. doi: 10.1021/acs.analchem.9b00680. Epub 2019 Apr 19. PMID: 30955322.
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