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酵母雙雜交服務(wù)

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泰克生物科技（天津）有限公司

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泰克生物（Tek Biotech）的酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system，Y2H）是由基于SMART法構(gòu)建的文庫(kù)、酵母菌株、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膱?bào)告基因、高表達(dá)載體組成的。

詳細(xì)介紹

泰克生物（Tek Biotech）經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，積累了豐富的免疫學(xué)研究與檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，建立了完善的分子基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)。泰克生物（Tek Biotech）的酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system，Y2H）是由基于SMART法構(gòu)建的文庫(kù)、酵母菌株、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膱?bào)告基因、高表達(dá)載體組成的。

酵母雙雜交系統(tǒng)是一種在基因水平上使用遺傳和分子方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的免疫學(xué)測(cè)試技術(shù)。這種方法只需要構(gòu)建質(zhì)粒，沒(méi)有涉及蛋白純化和抗體免疫階段，同時(shí)又能方便快速地獲得相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。Y2H可以用來(lái)篩選與靶蛋白相互作用的蛋白基因序列，也可以研究已知蛋白間的相互作用原理。

泰克生物（Tek Biotech）既能夠提供蛋白互作檢測(cè)服務(wù)，包括免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down等實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白，小分子，抗體等相互作用的定性定量分析；也能進(jìn)行ELISA、Western Blot等常用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）的原理：

酵母雙雜交系統(tǒng)原理-KMD Bioscience1.png

圖1 酵母雙雜交系統(tǒng)原理

DNA結(jié)合域（Bonding Domain, BD）: BD是一種能夠與特定的DNA分子序列結(jié)合從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)和自我復(fù)制的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。DNA BD存在于轉(zhuǎn)錄因子等許多基因調(diào)控元件中，賦予這些調(diào)控元件識(shí)別并結(jié)合特定DNA序列的功能，從而達(dá)到對(duì)下游基因調(diào)控的目的。

轉(zhuǎn)錄因子激活域（Activation Domain，AD）：AD是一段能夠在在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中激活基因轉(zhuǎn)錄的功能性蛋白質(zhì)序列，常存在于轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)中。AD可以通過(guò)與其他調(diào)控因子的相互作用形成蛋白質(zhì)復(fù)合物（轉(zhuǎn)錄因子、共激活因子和基因調(diào)控復(fù)合物等），從而使轉(zhuǎn)錄因子獲得可以結(jié)合到DNA特定序列，然后招募其他轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能。因?yàn)槊總€(gè)轉(zhuǎn)錄因子只能結(jié)合到特定的序列上，所以這個(gè)過(guò)程是高度特異性的。

在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將DNA BD和轉(zhuǎn)錄因子AD分別與Bait蛋白X融合和Prey蛋白Y形成融合蛋白。BD-Bait X融合蛋白可以識(shí)別并結(jié)合報(bào)告基因的上游激活子序列（Upstream Activation Sequence, UAS）。同時(shí)如果Bait X蛋白與Prey Y蛋白之間具有相互作用，這會(huì)使DNA AD與轉(zhuǎn)錄因子BD重新結(jié)合構(gòu)成具有啟動(dòng)報(bào)告基因功能的結(jié)構(gòu)域。

酵母雙雜交及系統(tǒng)是一種在細(xì)胞核中進(jìn)行利用基因水平技術(shù)來(lái)鑒定和檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白之間相互作用的方法。同時(shí)，Y2H也可以使用蛋白質(zhì)作為誘餌從所需的細(xì)胞類型、組織或整個(gè)生物體制備的蛋白質(zhì)片段庫(kù)來(lái)進(jìn)行篩選，然后通過(guò)對(duì)所選酵母菌菌落中相應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，從而確定相互作用。Y2H是在真核生物酵母中進(jìn)行的，具有靈敏性高、功能強(qiáng)大、適用范圍廣等特點(diǎn)，現(xiàn)已被應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。

酵母雜交檢測(cè)服務(wù)的分類：

為了研究蛋白質(zhì)的相互作用，科學(xué)家根據(jù)傳統(tǒng)的Y2H系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)了幾種系統(tǒng)以適應(yīng)不同蛋白質(zhì)的不同亞細(xì)胞定位和生化特征。泰克生物（Tek Biotech）為客戶提供多種系統(tǒng)的服務(wù)，以適應(yīng)不同項(xiàng)目的不同需求。

（1）酵母單雜系統(tǒng)（Yeast one-hybrid system，Y1H）：研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用。

酵母單雜交系統(tǒng)原理-KMD Bioscience2.png

圖2 酵母單雜交系統(tǒng)原理

酵母單雜交系統(tǒng)需要將Bait DNA序列整合到酵母基因序列中。將Prey蛋白構(gòu)建到AD載體中，與轉(zhuǎn)錄因子GAL4的AD結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)。如果Prey蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合Bait DNA序列，Prey蛋白所融合表達(dá)的AD結(jié)構(gòu)域就可以招募轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以激活報(bào)告基因的表達(dá)。

（2）酵母三雜交系統(tǒng)（Yeast three-hybrid system，Y3H）：研究?jī)蓚€(gè)蛋白質(zhì)和第三成分（蛋白、RNA或小分子）間的相互作用。

酵母三雜交系統(tǒng)原理-KMD Bioscience3.png

圖3 酵母三雜交系統(tǒng)原理

在酵母三雜交系統(tǒng)中，將兩個(gè)RNA結(jié)合蛋白X，Y分別于DNA BD和轉(zhuǎn)錄因子AD結(jié)合形成兩個(gè)融合蛋白。第三種成分可以為這兩個(gè)RNA結(jié)合蛋白X，Y提供兩個(gè)特定的RNA靶點(diǎn)來(lái)連接兩個(gè)融合蛋白。

（3）膜酵母雙雜交系統(tǒng)（Membrane yeast two-hybrid system，Mb Y2H）：用于研究膜蛋白

膜酵母雙雜交系統(tǒng)原理-KMD Bioscience4.png

圖4 膜酵母雙雜交系統(tǒng)原理

泛素（Ub）是一種蛋白質(zhì)，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)被分離成兩個(gè)基團(tuán)，并且當(dāng)它們靠近彼此時(shí)，其功能又可以進(jìn)行重構(gòu)。

在Mb Y2H系統(tǒng)中，將目標(biāo)膜蛋白Bait融合到半個(gè)泛素（Cub，泛素分子被截?cái)嗪蟮腃端）上，并且Cub上還連有一個(gè)含有人工轉(zhuǎn)錄因子（TF），該TF由細(xì)菌LexA-DNA BD和單純皰疹病毒VP16蛋白AD組成。將另一種目標(biāo)蛋白Prey（膜蛋白或細(xì)胞質(zhì)蛋白）融合到另外半個(gè)改造泛素（NubG/NubA，是將泛素分子被截?cái)嗪蟮腘端進(jìn)行改造，從而降低Cub與Nub兩者之間的親和性，避免其發(fā)生自發(fā)重組現(xiàn)象）上。所以只有當(dāng)結(jié)合在NubG/A的蛋白質(zhì)和結(jié)合在Cub的蛋白質(zhì)間相互作用時(shí)，才能使兩個(gè)半個(gè)泛素分子結(jié)合形成可以被泛素特異性蛋白酶（UBPs）識(shí)別作用的完整泛素分子。然后在酶的作用下，連接在Cub的調(diào)控因子被釋放進(jìn)入細(xì)胞核中，從而結(jié)合在特定的DNA序列上來(lái)激活轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因。

服務(wù)優(yōu)勢(shì)：

-- 技術(shù)專家直接服務(wù)，滿足不同檢測(cè)需要

-- 高準(zhǔn)確度分析儀器，經(jīng)驗(yàn)豐富的操作以及嚴(yán)格的質(zhì)量管理，保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠

-- 檢測(cè)服務(wù)效率高，過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)控

-- 檢測(cè)儀器靈敏度高，樣品消耗量低

-- 實(shí)驗(yàn)周期短，節(jié)省等待時(shí)間

-- 提供真正的一站式服務(wù)：從構(gòu)建文庫(kù)到陽(yáng)性克隆的篩選，這樣可提高效率，避免錯(cuò)誤，從而為客戶從客觀上節(jié)省費(fèi)用

服務(wù)內(nèi)容

服務(wù)流程	內(nèi)容	周期
客戶提供	不少于2 μg的質(zhì)粒（含誘餌靶基因）以及該基因的DNA序列，以便我們?cè)O(shè)計(jì)合成方案，進(jìn)行人工合成（需收費(fèi)）	***
創(chuàng)建BD-X誘餌	將誘餌靶基因連接到Y(jié)2H載體中去，并測(cè)序；誘餌靶基因可以是一段基因（酶切）或全長(zhǎng)基因	6-8周
通過(guò)BD-X誘餌測(cè)試自我激活	測(cè)試誘餌基因的自我激活能力和毒性
酵母雙雜交篩選并獲得識(shí)別獵物	文庫(kù)篩選和交互驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆的分離提取和DNA的測(cè)序
交付	陽(yáng)性克隆若干及DNA測(cè)序結(jié)果，每個(gè)陽(yáng)性克隆不少于2 μg質(zhì)粒